Virologia

 

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  • Le informazioni qui riportate hanno solo un fine illustrativo: non costituiscono e non provengono da prescrizione né da consiglio medico.

 

Virologia

 

Origine, struttura e capsidi                                                                               Lezione 1 del 22.10.07

 

By StarKeeper ed Alex S.                                                                                                                                             

 

La virologia è una scienza giovane, iniziata non più tardi di 100 anni fa, anche se le malattie virali sono descritte e conosciute da secoli. Ippocrate ipotizzò che le malattie fossero causate da animali invisibili per quanto piccoli. Il termine virus deriva dal latino e vuol dire veleno.

La virologia moderna inizia nei primi anni del 19° secolo, nel 1816, quando in contemporanea ricercatori tedeschi e francesi dimostrarono che, la malattia del mosaico del tabacco che determinava delle maculazioni sulle foglie delle piante del tabacco, se si facevano degli estratti di queste foglie e si mettevano su filtri di porcellana con dei pori molto piccoli che si erano già visti trattenere dei batteri, il filtrato che si otteneva riproduceva la stessa malattia su altre foglie di tabacco. C'era, quindi, qualche agente filtrabile che doveva essere più piccolo dei batteri. Poi si è visto successivamente che, a differenza dei batteri, questi agenti infettanti non erano in grado di propagarsi in soluzione ma avevano bisogno di materiale vivente, una cellula vegetale in questo caso. I primi studi da questi estratti servirono per fare le prime sperimentazioni e si vide che questo agente infettante sembrava essere solo una proteina, perché si vedeva un'unica proteina su gel di agarosio. Se però si metteva l'estratto su qualche animale da laboratorio, si producevano anticorpi. Nel 1935 Stanley riuscì a cristallizzare il TMV (virus del mosaico del tabacco) e ad osservarlo al microscopio elettronico. Successivamente Reed dimostrò che la febbre gialla era causata ugualmente da un agente filtrabile, come il TMV. Questa malattia è causata dalle infezioni di un virus, il virus amarillico, che viene trasmesso dalle zanzare.

Mentre la virologia vegetale aveva a disposizione piante, per i virus animali il discorso era un po' più difficile perché bisognava studiare la trasmissione di questi virus su animali (topi ma anche uovo embrionale di pollo che forma un sistema in cui molti virus possono crescere). L'uovo di pollo nel 1937 permise a Theller di coltivare il virus della febbre gialla ed allestire un vaccino. Dulbecco contribuì verso la metà del 900 alla messa a punto delle colture di tessuto, una tecnologia che permette di coltivare in laboratorio in vitro delle cellule di derivazione animale ed umana per utilizzarle in studi di biochimica, biologia molecolare ma anche virologia, dato che sono un ottimo substrato di crescita. Grazie proprio a queste tecnologie la virologia è diventata una vera scienza.

La virologia ha contribuito parecchio alla biologia moderna: scoperta della trascrittasi inversa (usata da alcuni virus che copiano a partire da uno stampo di RNA una molecola di DNA, ovvero i retrovirus). Questo ha sconvolto il dogma centrale della biologia, secondo cui da DNA si genera RNA e non il contrario; la virologia ha permesso anche l’identificazione di oncogeni che determinano la sorte positiva e negativa della vita di una cellula. Questi oncogeni sono stati scoperti nei virus che codificano per oncogeni, gli oncovirus, i quali appartengono alla famiglia dei retrovirus; la virologia ha consentito inoltre di approfondire i meccanismi di trascrizione e traduzione della cellula. Lo splicing alternativo è stato scoperto proprio nei virus, e poi si è visto che questi fenomeni avvenivano anche nella cellula; infine i virus sono implicati nelle tecniche di clonazione del DNA.

I virus sono strutture abbastanza semplici, quindi infettando con un virus una cellula, si può vedere quello che succede seguendo pochi parametri, mentre se si prende una cellula e la si studia in quanto tale avremo un sistema complesso con molti processi.

 

Cos’è un virus? Un virus è una via di mezzo tra un vivente che vive, si replica e cresce, ed un non vivente, una struttura immobile che non esprime nulla. Questa struttura immobile è detta virione. La differenza tra virus vivente e non vivente sta nella sua presenza all’interno o all’esterno di una cellula. Se un virus è presente fuori dalla cellula è un virus non vivente, ma quando riesce a penetrare dentro una cellula ospite può considerarsi un virus vivente. I virus sono quindi parassiti intracellulari obbligati (senza la cellula non esprimono niente). Esistono anche dei batteri che sono parassiti intracellulari obbligati però i virus presentano altre differenze. Essi sono di dimensioni estremamente piccole. Uno dei virus più grandi, il poxvirus, che ha determinato il vaiolo, è di 250 nm circa, mentre un batterio ha dimensioni di circa un micron. I virus più piccoli sono circa 18-20 nm (circa un poro nucleare di una cellula).

I virus possono essere anche molto grandi. Nel 92 è stato trovato dentro un corpo di un'ameba un virus detto mimivirus, grande 400-600nm, che ha un genoma molto vasto che codifica anche enzimi metabolici che danno luogo alla sintesi di precursori e AA.

I virus hanno altre peculiarità: mancano totalmente di un sistema di generazione di energia e ATP, quindi mancano di attività metabolica. Se non infettano una cellula sono come dei veri e propri cristalli. Mancano, inoltre, di tutti i sistemi di membrane e ribosomi (eccezione gli arenavirus che riescono ad incorporare dentro la loro struttura dei ribosomi di altre cellule). I virus hanno, inoltre, un solo tipo di acido nucleico (DNA o RNA) a differenze delle cellule. Esistono però delle piccole eccezione come il poxvirus, che ha anche tracce di RNA seppure il suo genoma è a DNA; anche nei retrovirus, che sono virus a RNA, troviamo qualche traccia di DNA, ma solo come acquisizioni non funzionali.

Durante il corso prenderemo in considerazione i virus animali, ma esistono anche i virus dei batteri ed i virus vegetali, che infettano le piante. Un virus ha uno spettro d'ospite ben specifico. Questo spettro d'ospite è dato dalla struttura del virione e quindi dalle proteine virali che formano lo strato più esterno della struttura del virione, ma è dato anche dai recettori cellulari, che devono essere presenti per infettare la cellula. Ci deve essere un'interazione tra il virione e la superficie della cellula ospite da infettare. Un virus presenta, quindi, cellule ospiti specifiche, ed è dotato di proteine virali e recettori particolari che sono in grado di permettere l’interazione tra il virione e i recettori della cellula ospite.

Lo spettro d'ospite può essere molto alto, come nei rhabdovirus, il cui nome è dato dal fatto che questi virus hanno una struttura a bastoncello; appartiene a questa famiglia anche il virus della rabbia. Questi virus hanno la stessa struttura e morfologia e quindi sono stati classificati in questa famiglia. Essi riescono ad infettare l'uomo ma anche delle cellule di insetto (non lo stesso virus ma virus simili della stessa famiglia). Alcuni virus infettano soltanto cellule di alcuni ospiti. Ad esempio il virus della Epstain Barr che da la mononucleosi, è in grado di infettare solo l'uomo, ed il suo spettro d’ospite è ristretto e limitato soltanto ai linfociti B. Caratteristica della mononucleosi è la proliferazione dei monociti, che determina l'ingrossamento dei linfonodi, soprattutto della zona sottomascellare. In questo caso si dice che la famiglia ha uno spettro d'ospite limitato. Infine altri virus, i batteriofagi, sono in grado di infettare solo alcuni ceppi di E. coli.

 

Origine dei virus.

Non ci sono risposte certe ma esistono comunque tre teorie fondamentali:

  • C’è la teoria dell'evoluzione regressiva che fa pensare che questi erano originariamente microrganismi parassiti intracellulari che nel corso del tempo si sono semplificati sempre di più fino a convertirsi nei virus attuali. Pensiamo ad un batterio che perde la capacità di sintetizzare enzimi, perde le membrane e si trasforma in un virus. In pratica si pensa che i virus siano forme di vita degenerate che hanno perso la maggior parte delle funzioni che gli altri organismi possiedono mantenendo solo le informazioni genetiche essenziali al loro stile di vita parassitario.
  • C'è la teoria dell'origine cellulare che suppone che, a partire da qualcosa di cellulare, come un acido nucleico cellulare mutato, si sia evoluta questa struttura, il virus appunto, in grado di autoriprodursi e autoreplicarsi. In pratica si pensa che i virus siano stati dei complessi subcellulari funzionali di macromolecole che si sono sottratti alle loro origini all'interno della cellula.
  • C'è infine la teoria delle entità indipendenti che suggerisce che i virus si siano evoluti parallelamente agli organismi cellulari a partire da molecole in grado in autoreplicazione, presenti nel primitivo mondo prebiotico a RNA. Questo poi nel tempo ha portato ad una coevoluzione parallela tra virus e cellule, con i virus che hanno sempre cercato di sfruttare al meglio il loro ospite per potersi riprodurre.

 

Esistono molti virus emergenti: questi infatti evolvono costantemente. La loro semplicità e velocità di replicazione determina un cambiamento costante del loro patrimonio genetico. Un virus che infetta la cellula può replicarsi fino a milioni di volte, quindi da una molecola di acido nucleico si replicano tra 106 e 108 molecole di nuovo materiale genetico; tuttavia durante questa replicazione il DNA viene sintetizzato da enzimi di origine virale. Questi enzimi sono polimerasi più semplici di quelle che sono presenti nelle cellule eucariotiche e sono prive di sistemi di correzione. La DNA polimerasi virale quindi non possiede un sistema di correzione per sostituire eventuali basi inserite non correttamente durante la replicazione, per cui il materiale genetico virale è soggetto ad una continua evoluzione che da origine a nuovi prodotti proteici, quindi a nuovi virus con nuove caratteristiche.

Anche i virus a RNA hanno un’elevata frequenza di mutazione a causa della presenza di una RNA polimerasi virale che non è in grado di correggere eventuali errori di replicazione; questo determina variabilità genetica con una divergenza che può arrivare al 2% per anno; in un anno una sequenza nucleotidica può variare al 2%, e questo determina una nuova risposta immunitaria. Esiste anche un altro meccanismo che è limitato solo ad alcuni tipi di virus, come quelli influenzali, che hanno un genoma segmentato su vari pezzi. Se due virus diversi infettano lo stesso ospite, dopo la replicazione nella cellula ospite, nel meccanismo di uscita dalla cellula, si può dar origine ad un mix, cioè ad un virus completamente diverso con segmenti vari. Il fenomeno è detto antigenic shift, shift antigenico, ed è quello che causa le pandemie ed il riassortimento (qui la prof parlando di pandemie ride inspiegabilmente da sola, vedi sindrome compulsiva, vedi sindrome Borderline :P ).

Esistono anche altri fenomeni di evoluzione dei virus che riguardano gli anticorpi dell'ospite. Il virus influenzale che ha circolato l'anno scorso ed ha infettato moltissime persone, se si dovesse ripresentare l’anno successivo nella stessa forma, quindi privo di ulteriori mutazioni, sarebbe facilmente eliminato dalle cellule del sistema immunitario dell’ospite, e per questo che quindi i virus evolvono e cambiano.

Anche lo spettro d'ospite può essere una causa di evoluzione dei virus. Il virus ebola non è un virus umano ma ogni tanto si verifica un passaggio d'ospite per cui un uomo può essere infettato. Questo virus è endemico nei pipistrelli, ma, in certi casi, può passare alle scimmie ed infine all'uomo. La mortalità è circa dell'80% ed è causata da emorragia dei tessuti. Se questo virus fosse sempre costante, dovremmo avere costantemente dei focolai di infezione ma, invece, queste epidemie avvengono saltuariamente in Africa. Per fare questo salto d'ospite devono generarsi dei salti con delle mutazioni che permettono il passaggio dalla scimmia all'uomo.

L'aviaria infetta gli uccelli ma da qualche anno si è identificato un ceppo virale di influenza aviaria che è in grado di infettare l'uomo con un tasso di mortalità del 50-60%. Questo virus potrebbe, inoltre, subire ulteriori mutazioni che gli consentirebbero il passaggio da uomo a uomo, il che aumenterebbe la gravità della situazione.

L’utilizzo di farmaci permette di selezionare i virus; usando un farmaco, infatti, si possono selezionare i mutanti ad esso resistenti.

 

Struttura di un virus.

Innanzitutto è presente un acido nucleico, che può essere DNA o RNA. Nel 1957 Conrat e Williams dimostrarono che era possibile ricostruire in laboratorio il virus del tabacco partendo dall'acido nucleico del virus e dalle proteine purificate. In questo modo si poteva creare un virus. Questo esperimento dimostra che i virus sono formati da acido nucleico e proteine, e che queste strutture sono autoassemblanti. Il virus si forma a partire dai suoi costituenti. E’ presente quindi un acido nucleico a DNA o a RNA che costituisce il genoma del virus. Questo acido nucleico è racchiuso in una struttura proteica detta capside, formata soltanto da proteine. In alcuni casi genoma e capside possono essere contenuti in un involucro esterno pericapsidico, che viene detto in inglese envelope; questo involucro pericapsidico è un rivestimento di natura lipoproteica, cioè è formato da un doppio strato lipidico contenente proteine transmembrana ed intramembrana, che sono di derivazione virale. Lo strato lipidico invece è ricavato direttamente dalla cellula ospite. Le glicoproteine che fuoriescono vengono dette peplomeri o “spike” in inglese.

Il genoma del virus può essere o a DNA o a RNA. La quantità di acido nucleico nel virione può variare dall'1% (virus influenzali) al 50% (batteriofagi). La quantità di informazione genetica è abbastanza limitata nei virus. Essi quindi tendono ad economizzare al massimo la loro informazione genetica usando un numero minimo di proteine. Il virus dell'epatite B ha un genoma di 3kb che codifica per 4 geni. Esso utilizza il DNA completo partendo da finestre di lettura diverse. Virus più grandi come quello del vaiolo (il poxvirus) hanno un DNA che può essere di 300kb, e che codifica per molti geni. Il mimivirus, il virus dell'ameba, contiene 1,2MB, e codifica anche per proteine con attività enzimatica. Una caratteristica dei virus è che il loro acido nucleico è presente in un'unica copia, sono aploidi come i batteri, mentre le nostre cellule presentano due copie della stessa molecola di DNA. Tuttavia nei virus esiste un eccezione, i retrovirus, che invece sono diploidi. Le molecole virali di acido nucleico sono di forma lineare ma esistono talvolta virus con genoma circolare come i papovavirus.

 

Genomi a DNA.

Il DNA generalmente è a doppia elica ma esistono virus, come i parvovirus, che hanno un DNA a singolo filamento. Se immaginiamo di dover replicare una molecola di DNA a doppio filamento avremo sempre il problema dei primer e della perdita delle estremità del filamento. Molti virus però hanno adottato delle strategie, come i poxvirus che hanno le estremità delle due eliche unite tra loro. Altri virus usano come primer delle proteine legate covalentemente alle molecole di DNA. In questo modo i virus evitano la perdita delle estremità del loro genoma. Altre strategie sono quelle di avere, nelle parti terminali del filamento, delle sequenze ridondanti e ripetute (terminal repeats), come il genoma dell’adenovirus. In questo modo i virus cercano di non perdere le loro parti terminali; infatti, se sono presenti delle estremità terminali ripetute, a livello della replicazione si potrà avere l'appaiamento delle due molecole e si formerà di per se il primer per non perdere le estremità terminali. I virus possono portare al loro interno una quantità di informazione genetica limitata e, quindi, cercano di sfruttare al meglio questa quantità limitando inoltre eventuali perdite di informazione. Il poliomavirus della scimmia ha un genoma circolare e trascrive 9 proteine usando sia un elica che l'altra elica complementare. Gli adenovirus possono sintetizzare trascritti a partire da entrambi le eliche. I virus quindi riescono a sfruttare entrambe le eliche. Il virus, in questo modo, raddoppia la sua capacità codificante di DNA. Per la replicazione i virus sfruttano determinate sequenze di DNA che vengono chiamate ori, e che sono delle origini di replicazione. A livello della trascrizione esistono delle regioni di controllo simili a quelle eucariotiche, sequenze promoter ed enhancer, che facilitano la trascrizione e che sono regolate da fattori virali e cellulari.

 

Genomi a RNA.

La maggior parte dei virus ad RNA presentano una molecola lineare a singolo filamento di RNA. Esistono però anche dei virus come i Reovirus (come il rotavirus) che hanno RNA lineare a doppio filamento. Questi genomi a RNA sono, o un unico filamento, oppure possono essere segmentati, come nel caso dello shift antigenico del virus influenzale, che presenta otto segmenti. Anche l’RNA a doppio filamento dei reovirus risulta segmentato.

I retrovirus sono gli unici virus che possiamo considerare diploidi ed hanno un RNA a filamento singolo che però è doppio e non appaiato, quindi sono presenti due molecole identiche di acido nucleico. I virus a RNA vengono distinti in virus a RNA a polarità positiva e virus a RNA a polarità negativa. Una molecola di RNA a polarità positiva può fungere da messaggero e quindi nelle infezioni può legarsi ai ribosomi cellulari attivando la sintesi proteica virale. Quindi i virus ad RNA a polarità positiva hanno genomi che, una volta entrati, possono legarsi ai ribosomi ed esprimere proteine virali. Le molecole di RNA di questi virus, come i messaggeri cellulari, hanno un cap e delle code di poli A, anche se sono presenti eccezioni che considereremo in seguito.

Gli RNA a polarità negativa, invece, non possono fungere da messaggeri, ed una volta penetrati nella cellula ospite devono essere trascritti da polimerasi virali per formare degli RNA di polarità positiva, che verranno poi utilizzati come messaggeri virali in grado di legarsi ai ribosomi cellulari e quindi in grado di esprimere proteine virali. La peculiarità di un virus è quella di penetrare in una cellula ospite e replicarsi, sfruttando gli apparati cellulari dell’ospite per risintetizzare i suoi costituenti. Un virus, durante un’infezione, deve quindi risintetizzare le proteine virali codificate dal suo genoma; queste proteine sono autoassemblanti ed interagiscono con i genomi virali replicati nell’ospite partecipando alla formazione dei capsidi. Una volta riassemblate numerose copie del virus, queste dovranno poi fuoriuscire dalla cellula ospite, provocandone la lisi (non per forza).

Esiste un ulteriore differenza come gli ambisense che sono dotati di RNA in parte a polarità positiva ed in parte a polarità negativa. I genomi a RNA positivo sono forniti di cap ma esistono anche virus a RNA positivo che non hanno il cap. Essi formano però delle strutture particolari dette IRES, che sono siti di entrata al ribosoma. Queste molecole di RNA possono, quindi, interagire con il ribosoma bypassando l'assenza del cap. Oltre alla sequenze di origine della trascrizione e della replicazione, i virus devono avere nel loro genoma delle sequenze specifiche di incapsulamento che permettono l'interazione tra genoma virale (che viene selezionato rispetto a quello cellulare) e proteine del capside, permettendo l'auto-assemblaggio del virus.

 

Capsidi virali.

Tutti i capsidi virali sono formati da proteine identiche o quasi, in grado di autoassemblarsi. Queste proteine che formano il capside sono legate tra di loro tramite legami abbastanza forti di natura polare come legami ionici e legami a idrogeno, ma anche da legami più deboli di natura non polare come interazioni idrofobiche e forze di van der Waals. Le interazioni tra le varie proteine devono essere precise e sempre le stesse per la struttura del capside. Il capside è molto importante per i virus in quanto protegge l'acido nucleico, che non è molto stabile poiché risulta sensibile sia ai raggi ultravioletti che all'azione di nucleasi presenti nelle cellule e nei liquidi extracellulari. Ad eccezione dei virus dotati di involucro pericapsidico, il capside virale rappresenta lo strato più esterno del virus, che prende contatto con le cellule ospiti tramite le proprie proteine virali.

I capsidi determinano anche la forma del virione. I capsidi possono essere di forma elicoidale come il virus del mosaico del tabacco; questa è la caratteristica di quasi tutti i virus a RNA.

Inoltre i capsidi possono essere anche di forma icosaedrica, forma presente nei virus a DNA e in alcuni virus a RNA. Alcuni virus hanno un capside complesso che non permette di identificare nessuna forma standard in quanto presentano una struttura più complessa, come nel caso del poxvirus o dei batteriofagi.

I capsidi elicoidali sono formati da un'unica proteina che prende contatto con l'acido nucleico di RNA e lo avvolge a spirale per formare particelle bastoncellari, che abbiamo già visto nel TMV. Questa proteina unica viene chiamata spesso proteina N (proteina nucleocapsidica basica) ma più in generale protomero. La proteina N svolge il compito di stabilizzare l'RNA genomico e di proteggerlo da danni chimici, fisici ed enzimatici. Il protomero costituisce la proteina singola del capside, l’unità di base. Tutte queste proteine devono avere la stessa interazione tra di loro. Esse sono generalmente legate coda a coda e formano un nastro con un asse di rotazione. La grandezza della spirale, dell'elica e del passo dell'elica dipende dalla grandezza di questa proteina. Oltre ad avere queste interazioni lungo l'asse della spirale, per la compattezza della spirale, i vari protomeri (unità proteiche uguali che si autoassemblano) devono prendere contatto anche tra di loro. La grandezza di questi capsidi dipende soltanto dalla lunghezza del genoma. L'assemblaggio tra RNA e capside viene detto nucleocapside.

Il nucleocapside di un paramixovirus ha un RNA a polarità negativa di circa 16-18kb. Ogni sei nucleotidi c'è una proteina N che lega questo RNA e lo avvolge a spirale per formare il nucleocapside. Nel virus del tabacco una proteina lega 3 nucleotidi e quindi è più piccola. Se i virus sono privi di involucro questi capsidi devono essere rigidi; tuttavia non esistono virus animali con capside rigido, poiché questi virus hanno l'involucro. I virus vegetali, come il TMV, hanno invece un capside rigido. Un virione con involucro e con capside elicoidale avrà un involucro pericapsidico sferico, con all'interno un capside elicoidale più flessibile. Alcuni virus hanno però una forma diversa come i rhabdovirus (virus della rabbia) che hanno una forma a bastoncino con all'interno un capside elicoidale. Tra nucleocapside ed envelope si trova uno strato amorfo presente nella maggior parte dei virus con envelope, le cui proteine interagiscono sia con la regione centrale che con la faccia intravirionica della membrana lipidica, tenendo queste due strutture associate tra di loro. Questa struttura è chiamata matrice. Questo è possibile grazie al fatto che al di sotto dell'involucro esiste una proteina che viene detta proteina di matrice. La proteina di matrice, proteina M (proteina più abbondante nelle particelle virali), presenta una struttura rigida che può determinare una forma diversa come nel caso dei rhabdovirus.

 

Simmetria icosaedrica.

Anche i capsidi icosaedrici sono formati da proteine identiche o almeno da proteine con identici rapporti l’una con l'altra. Se dobbiamo immaginare qualcosa di solido costruito da blocchi che abbiano interazioni identiche tra di loro, possiamo immaginare un tetraedro (12 subunità), un cubo (24 subunità) o un icosaedro (60 subunità). Si è visto che la simmetria icosaedrica è quella più efficace per quanto riguarda le necessità dei virus, in quanto, anche se prevede un numero di subunità maggiore, queste possono essere più piccole a parità di cavità. Per formare un cubo sono necessarie proteine molto grandi e quindi c’è una conseguente necessità di molta informazione genetica che codifichi per queste proteine. Al contrario, per costruire una faccia di icosaedro, è necessario avere proteine più piccole ed identiche. La simmetria icosaedrica è quella più idonea per la costruzione di involucri e, poiché le proteine necessarie sono piccole ed identiche, questa simmetria permette di usare al minimo il patrimonio genetico del virus. L'icosaedro è un solido e presenta 20 facce formate da angoli equilateri e 12 vertici. Ogni faccia può essere formata da unità strutturali identiche e ripetute anche nelle loro interazioni (ovvero proteine che formano i protomeri). Queste proteine che costituiscono il capside vengono chiamate capsomeri; un capsomero è un’unità proteica strutturale, composta da più proteine (non più di tre o quattro) o da agglomerati di una stessa; esso è visibile al microscopio elettronico. La proteina singola del capside, l’unità di base, viene definita protomero.

Nell'icosaedro, ai vertici è presente un numero di palline diverso rispetto alle facce dei triangoli; ai vertici ci sono cinque di queste palline mentre sulla superficie piatta della faccia ce ne sono sei. Sui dodici vertici dell'icosaedro ci sono i pentoni, che sono cinque proteine che formano i capsomeri dei 12 vertici, mentre sulle venti facce sono presenti gli esoni, che sono sei proteine che formano i capsomeri delle 20 facce. Dato che l'icosaedro ha 12 vertici e 20 facce in totale avremo come minimo venti esoni e dodici pentoni.

Le regole che determinano la formazione di un icosaedro sono di fatto gli assi di simmetria rotazionale, conosciti come assi di simmetria 2-3-5 che hanno le seguenti proprietà:

  • Un asse di simmetria rotazionale binaria passa al centro di ogni spigolo tagliando a metà il solido;
  • Un asse di simmetria rotazionale ternaria passa per il centro di ogni faccia;
  • Un asse di simmetria rotazionale pentamerica passa al centro di ogni spigolo o vertice.

Virologia

 

Struttura e classificazione                                                                                 Lezione 2 del 25.10.07

 

Virus a simmetria icosaedrica.

Le varie simmetrie che possono formare una struttura stabile sono la tetraedica, la cubica e la icosaedrica, e devono essere formate da subunità diverse. La simmetria icosaedrica, per formare una cavità sufficientemente grande al fine di contenere il genoma del virus, anche se prevede un numero di subunità maggiore, necessità di subunità che possono essere più piccole. L'icosaedro è formato da un solido con 20 facce, costituite da triangoli equilateri, e presenta 12 vertici e 30 spigoli. Le proteine di cui sono formati questi icosaedri vengono chiamate protomeri, le unità di base del capside. I protomeri possono unirsi tra loro per formare delle strutture più evidenti che possono essere visualizzate al microscopio elettronico; queste strutture vengono chiamate capsomeri e costituiscono le unità strutturali, composte ciascuna da più proteine o da agglomerati della stessa. I capsomeri possono quindi essere formati da un unico polipeptide o da più polipeptidi, e questo dipende dalla grandezza del capside.

Nei virus a simmetria icosaedrica i protomeri sono organizzati in pentoni (ai vertici, sempre 12) e, nei virus più grandi, i protomeri sono organizzati anche in esoni (presenti su facce e spigoli).

I virus con simmetria icosaedrica non necessariamente hanno una forma icosaedrica che è uguale per tutti, in quanto possono essere presenti nella struttura più forme, che possono variare nei diversi virus, anche se la simmetria icosaedrica rimane la stessa. La forma, la grandezza ed il numero dei capsomeri varia da virus a virus. Le regole che governano la formazione di un icosaedro sono gli assi di simmetria rotazionale, conosciuti come assi di simmetria 2-3-5, di cui l’asse di simmetria 5 passa per il centro di ogni vertice dell’icosaedro, la simmetria 3 passa per il centro di ogni faccia, e la simmetria 2 passa per il centro di ogni spigolo. Nella costruzione di un icosaedro si può anche partire da un foglio piano, il quale può essere diviso in vari esagoni contenti ognuno 6 triangoli equilateri. Si può eliminare un triangolo da ogni esagono, ed in questo modo viene a formarsi un pentagono con forma tridimensionale. Unendo 12 di queste strutture tridimensionali si forma un icosaedro. Un triangolo è costituito da più proteine; abbiamo infatti visto che i virus hanno poca informazione genetica per costruire la loro struttura, in quanto oltre alle proteine strutturali devono codificare anche per le proteine enzimatiche necessarie per la replicazione; quindi i virus cercano di economizzare usando, come informazione genetica necessaria per la costruzione del capside, dei corti segmenti di DNA che quindi codificano per proteine abbastanza piccole. La maggior parte dei virus per costruire una faccia dell'icosaedro utilizza tre piccole proteine, le quali possono essere identiche tra loro; più le proteine sono identiche più riescono a mantenere identici contatti, e questo è alla base della solidità dei capsidi. Per facilitare i contatti tra le diverse proteine, le proteine che formano il capside hanno tutte una forma a cuneo, detta Jelly roll β barrel. Queste proteine presentano lunghi foglietti β, e qualche α elica, per avere la possibilità di prendere contatti stretti tra di loro; i legami tra le proteine, infatti, vengono dati da anse ad α elica che consentono l’aggancio tra le varie subunità proteiche. I capsidi molto piccoli, come quello del batteriofago FX174, sono effettivamente formati da un'unica proteina. Ogni triangolo è costituito dalla ripetizione di un'unica proteina. Si deduce che il numero minimo di proteine che deve essere contenuto in un capside icosaedrico è 60, in quanto per ogni faccia sono presenti minimo 3 proteine, quindi 20 facce moltiplicate per 3 proteine per ogni faccia dà un minimo di 60 proteine. Per costruire un capside più grande si può dividere la faccia triangolare in ulteriori triangoli equilateri; ogni triangolo equilatero sarà sempre formato da almeno 3 subunità proteiche; in questo modo aumenta il numero di subunità che possono essere ripetizioni della stessa proteina o proteine leggermente diverse. Dal numero di triangoli sui quali si divide una delle facce dell'icosaedro si può ricavare il numero T, che è utile in virologia per conoscere il numero di capsomeri che presenta il virus, nonché il numero di proteine.

Il numero dei capsomeri può essere dato da questa formula: N = 10x(n-1)2+ 2; n corrisponde al numero di capsomeri contenuti in una faccia del triangolo equilatero; quindi basta sapere in quanti ulteriori triangoli è stato diviso il triangolo equilatero dell’icosaedro per identificare il numero di capsomeri. Un adenovirus ha n uguale a 6. Quindi facendo la formula, 10x(6-1)2+2, si scopre che tutto il capside dell’adenovirus è formato da 252 capsomeri, anche se le proteine possono essere molte di più; si consideri che il capsomero è soltanto l’unità strutturale visibile al microscopio. Ogni capsomero di adenovirus è, infatti, formato da tre proteine uguali, del resto è un virus esteso che ha bisogno di ulteriori proteine, che sono proteine di adesione che fanno da collante. Il capsomero è quello che si può osservare visivamente al microscopio elettronico ed è quindi un complesso di proteine, il cui numero varia a seconda del virus. Il triangolo equilatero più grande corrisponde alla faccia dell’icosaedro, che può essere divisa ulteriormente in triangoli più piccoli, i capsomeri, che in questo caso sono formati da tre proteine ciascuno (numero che può cambiare da virus a virus).

Nel poliovirus il capside è formato da 60 copie di tre proteine distinte, VP1, VP2 e VP3; infatti ogni faccia presenta tre copie di ogni proteina. La VP1, unendosi ad altre 4 proteine VP1 identiche, va a formare il pentone al vertice del triangolo. Il resto della superficie è occupato dalle proteine VP2 e VP3. I picornavirus, di cui fa parte il poliovirus, hanno una simmetria T=3, e ciò vuol dire che il triangolo equilatero che costituisce la faccia dell’icosaedro, deve essere diviso in 3 ulteriori triangoli equilateri, ciascuno contenente tre proteine.

Le proteine VP1 sono responsabili della formazione del capsomero dei pentoni, ai vertici del triangolo, mentre le VP2 e le VP3 portano alla formazione del capsomero degli esoni, al centro della faccia del triangolo; ricordiamo che i capsomeri sono unità strutturali visibili al microscopio, formate da aggregazioni di proteine che possono essere identiche o diverse tra loro. I capsomeri che si trovano ai vertici vengono detti pentoni mentre quelli che si trovano sulla faccia del triangolo vengono detti esoni. La struttura dell'esone può essere diversa. In questo caso ciascuna faccia è stata divisa in 3 triangoli, con un totale di 60 triangoli più piccoli, ciascuno contenente tre proteine, per un totale di 180 proteine. L’interno del capside è una struttura molto piccola, attorno ai 18 nm, in cui può alloggiare una molecola di genoma di circa 10 kb. Le proteine VP1, VP2 e VP3 presentano grosso modo la stessa struttura del jelly roll β barrel; sono caratterizzate, infatti, da foglietti beta antiparalleli con anse ad alfa elica che permettono l’aggancio tra le varie subunità proteiche.

I vari componenti dei capsidi icosaedrici possono autoassemblarsi. Per capsidi molto grandi, come quello dell'herpes virus, il loro assemblaggio necessita di particolari proteine chiamate proteine scaffold, che permettono la formazione di un'impalcatura sulla quale si può costruire il capside icosaedrico. Generalmente queste proteine di impalcatura, una volta svolto il loro ruolo, vanno incontro a degradazione. I capsidi più grandi hanno bisogno di proteine “collanti” che vengono inserite nei capsidi per mantenerne la struttura.

Non verrà chiesta in dettaglio la struttura icosaedrica di un tipo particolare di virus.

 

Struttura dei virus e gemmazione.

I capsidi icosaedrici, cosi come anche quelli elicoidali, possono essere contenuti in un involucro. Alcuni virus vengono detti nudi, nei casi in cui è presente soltanto il capside come struttura terminale e più esterna del virione, che è quindi infettante in queste condizioni.

Altri virus, come l’herpes simplex, per essere infettivi devono possedere, oltre al capside icosaedrico, anche un involucro. Solo con l'involucro questi virione sono infettivi e completi. L'involucro è una struttura lipoproteica formata da un doppio strato lipidico identico ad una membrana cellulare. Questa struttura non viene sintetizzata dal virus, ma viene prelevata dalle membrana delle cellule infettate. Questi involucri, infatti, possono essere biochimicamente diversi, in quanto la loro struttura dipende dal sito di gemmazione del virus. Per esempio la MP è diversa dalla membrana del reticolo endoplasmatico. Nella MP, infatti, c’è più colesterolo. I virus che acquisiscono la membrana dalla MP delle cellule saranno dotati di colesterolo. Le proteine sono invece di derivazione virale e presentano importanti funzioni. Le proteine virali sono generalmente raggruppate in formazioni trimeriche o tetrameriche sulla superficie dell’involucro; queste strutture sono visibili al microscopio elettronico e vengono dette spicole (in inglese spikes).

Per quanto riguarda il virus influenzale esistono due tipi di proteine presenti sull’involucro lipidico; la prima proteina è chiamata emoagglutinina, che ha la capacità di agglutinare legandosi ai recettori dei globuli rossi, permettendo in questo modo la fusione tra la membrana virale e quella cellulare per l’ingresso del virus nella cellula; l’altra proteina è un enzima detto neuroaminidasi, che taglia l'acido sialico, una parte terminale delle catene glucidiche delle glicoproteine; l’acido sialico è una ripetizione di due-tre molecole di N acetil-glucosammina.

Altri virus con involucro sono i rhabdovirus, di cui fa parte il virus della rabbia. Questi hanno un'unica proteina sull'involucro, la proteina G. L'involucro conferisce tendenzialmente una forma sferica, anche se ci sono virus che possono avere una forma più allungata; il motivo verrà analizzato successivamente.

Mentre le altre proteine strutturali del virus vengono fatte sui ribosomi liberi, le glicoproteine virali, come quelle cellulari, vengono sintetizzate dai ribosomi sul reticolo endoplasmatico; quindi entrano nel reticolo endoplasmatico e da lì procedono nell’apparato del golgi, dove vengono glicosilate. Tutte le proteine che subiscono questa trasformazione poi procedono verso la membrana e in questo modo le glicoproteine virali sintetizzate dal virus riescono ad arrivare sulla membrana plasmatica della cellula. La maggior parte delle proteine della membrana cellulare vengono allontanate e si formano invece dei patch, degli agglomerati di glicoproteine virali. Da queste zone il virus, con il suo genoma e le proteine, va incontro a gemmazione, portando con sé le sue glicoproteine insieme ai lipidi della membrana della cellula.

I virus con involucro possono avere forme diverse; questi virus vengono detti pleiomorfi. In altri virus, come il rhabdovirus, è presente sempre la stessa forma e questo è dovuto alla presenza al di sotto dell'involucro lipidico di una proteina M (da proteina di matrice); questa proteina M viene acquisita durante il processo di gemmazione. Al di sotto dell’involucro lipidico che contiene tutte le proteine di origine virale di tipo transmembrana, c’è lo strato della proteina di matrice e poi, procedendo verso l’interno, è presente un vuoto in cui è inserito il nucleocapside del virus. Nel rhabdovirus la proteina M ha una struttura più rigida e ciò conferisce una forma più specifica.

Esistono, poi, virus con involucro che però non hanno la proteina M; l'unico caso sono i Togavirus, in cui le code citoplasmatiche delle proteine dell'involucro prendono contatto direttamente con le proteine del capside, che in questo caso è icosaedrico. E' fondamentale che ci sia questo contatto diretto tra involucro e capside interno. Ci deve essere sempre un ponte molecolare tra lo strato più esterno e quello più interno; nei Togavirus la connessione è data dalle proteine dell’involucro, mentre nel caso del virus dell’influenza la connessione è data dalla proteina M.

Questa differenza tra i diversi virus è dovuta al fatto che questi gemmano in maniera differente. Nei virus dotati di capside icosaedrico e privi di proteina M, il capside viene preformato nel citoplasma della cellula; le glicoproteine sintetizzate dal virus vengono trasportate sulla membrana cellulare, e le proteine del capside prendono direttamente contatto con le code citoplasmatiche di queste glicoproteine della membrana cellulare. Quindi nel corso della gemmazione viene a trovarsi parte della membrana cellulare con le glicoproteine virali che interagiscono, attraverso le loro code citoplasmatiche, con le proteine del capside icosaedrico. I contatti che si creano tra queste componenti proteiche, di membrana e capsidiche, fanno si che l’intera struttura (parte della membrana con le glicoproteine più le proteine capsidiche che formano il capside) tenda ad estroflettersi e a gemmare dalla membrana della cellula. Alla fine questa struttura si libera dalla cellula, ed è caratterizzata da un involucro esterno che racchiude il capside, con le glicoproteine sulla superficie che prendono direttamente contatto con il capside.

Per quanto riguarda invece il virus influenzale, la situazione è differente; infatti sotto la membrana che contiene le glicoproteine del virus si va a posizionare la proteina di matrice, la quale prende contatto a sua volta con il capside elicoidale di questi virus; ricordiamo che questi virus hanno un genoma segmentato e quindi sono presenti più capsidi elicoidali. In questo caso la forza che provoca la gemmazione del virus è il compattamento delle proteine di matrice. Queste proteine compattandosi, quando nucleocapside e glicoproteine prendono contatto, provocano il processo di gemmazione; infatti una volta compattate, spingono verso l’esterno, portandosi dietro il capside e l’involucro, e determinando cosi la fuoriuscita del virus dalla cellula.

Ci sono ancora altri modi con cui un virus può uscire dalla membrana cellulare. Un tipo è il meccanismo del virus HIV. Le glicoproteine del virus HIV vengono sempre a trovarsi sulla membrana cellulare. L'HIV, tuttavia, ha adottato un'altra strategia di gemmazione; infatti sotto la membrana cellulare, nei punti in cui sono presenti le glicoproteine virali, si va ad attaccare una poliproteina; all'inizio è presente una proteina che si chiama MA, e che prende contatto con le code citoplasmatiche di questa proteina, poi è presente una proteina che si chiama CA, ed altre. Al di sotto della membrana, attraverso dei tagli da parte della proteasi codificata dal virus, viene a formarsi a partire da questo precursore iniziale, lo strato della matrice e lo strato del capside; quindi la formazione di tutto il capside e dello strato della matrice avviene durante il processo di gemmazione. Il virus HIV presenta involucro e proteine della matrice ed ha un capside a forma tronco conica.

Altri virus, come l'herpes virus, hanno anche loro un involucro caratterizzato sempre da glicoproteine, ma sono privi di uno strato di matrice, il quale sarebbe visibile al microscopio elettronico come una demarcazione più scura al di sotto dell'involucro; invece questi virus hanno al di sotto dell’involucro una regione particellata e chiara, caratterizzata da proteine strutturali chiamate proteine del tegumento.

Un virus complesso è il poxvirus dove non è riconoscibile alcuna simmetria specifica sia all'esterno che all'interno. Il poxvirus è un virus complesso, che non opera il processo di gemmazione sulla superficie cellulare, ma viene avvolto da membrane del reticolo endoplasmatico, ed in questo modo acquisisce due membrane. La struttura di questo virus è una sorta di mattoncino ovale, con alcune striature. E’ presente uno strato esterno che circonda due corpi laterali e una regione centrale biconcava e schiacciata nel mezzo; questa regione centrale contiene il DNA, il quale viene complessato da una nucleoproteina molto compressa.

Altri virus complessi sono i reovirus, di cui fa parte il rotavirus; questi virus sono formati da tre capsidi di natura icosaedrica, disposti uno su l'altro.

Gli studi sui virus avvengono tramite microscopio elettronico. Si spruzzano sui vetrini delle sostante elettrondense che danno colorazione negativa, così da vedere l'ombra delle sostanze elettrondense, oppure si possono usare colorazioni positive. Adesso si usa il criomicroscopio che permette di analizzare meglio la struttura. La risoluzione è pari a 7A. Se cristallizziamo una struttura possiamo anche fare un'analisi ai raggi X ad alta risoluzione anche se non tutte le proteine possono essere cristallizzare e quindi non tutti i virus possono essere studiati a questo livello.

 

Nomenclatura dei virus.

I nomi dei virus sono i più disparati ed il virus spesso prende il nome dalla malattia che determina (es. virus del morbillo, dell'influenza). Altre volte, invece, il nome deriva dalla morfologia del virus,  come il rotavirus che ha tre capsidi uno sull'altro; questo virus, quando viene osservato in sezione, assomiglia un po' ad una ruota e per questo viene chiamato rotavirus. I virus possono anche prendere il nome dal luogo dove sono stati isolati, mentre altre volte il virus prende il nome dallo scienziato che l'ha scoperto, come il virus di Epstein Barr, che appartiene alla famiglia degli herpes virus, e che causa mononucleosi. Altre volte ci possono essere degli acronimi, come la famiglia dei papovavirus, che comprende virus molto differenti; il nome di questa famiglia deriva dal fatto che contiene il virus del papilloma, che causa alle donne cancro della cervice uterina.

Sono stati identificati nel mondo più di 4000 diversi virus animali. La necessità di classificazione è importante in quanto un virus, anche se è sconosciuto, nei casi in cui si riesce ad identificarne la famiglia di appartenenza, si può probabilmente comportare a livello di replicazione in maniera simile rispetto alla sua famiglia e si possono quindi prevedere le sue caratteristiche patogene; si possono pertanto dedurre alcune caratteristiche ed assimilarle ai virus conosciuti.

I criteri di classificazione sono le loro caratteristiche morfologiche (capside, involucro ecc), caratteristiche genomiche (DNA, RNA, molecola di acido nucleico lineare o circolare, polarità positiva o negativa, ecc) e le caratteristiche biologiche (la tipologia di cellule che il virus è in grado di infettare). Seguendo questi principi i virus umani sono stati suddivisi in 56 famiglie, almeno per quanto riguarda i virus umani che comprendono anche virus animali. In virologia, per indicare la famiglia, si aggiunge il termine viridae. Per indicare la famiglia dei Rhabdovirus si scrive, quindi, rhabdoviridae. In virologia esiste soltanto un ordine, quello dei mononegavirales. Questi virus vengono detti mono in quanto sono a singolo filamento, nega poiché sono negativi (virus a RNA), e infine virales indica l'ordine. Le famiglie possono a volte essere divise in sottofamiglie, indicate con il termine virinae; per esempio nell'herpes virus ci sono tre sottofamiglie. Le famiglie poi vengono suddivise in generi; i generi poi contengono le singole specie di virus, come il virus della rabbia, e a volte le specie prevedono ulteriori suddivisioni in tipi e ceppi.

Questa classificazione, se fatta su basi morfologiche e genetiche, riesce a raggruppare tutte  le famiglie, mentre se vogliamo arrivare alle sottofamiglie dobbiamo prendere in considerazione anche l'aspetto biologico, quindi la capacità del virus di infettare determinate cellule. Per quanto riguarda i generi questi sono divisi a seconda della variabilità genetica e delle sequenze genomiche di questi virus, mentre le specie sono i singoli virus. I tipi e i ceppi (di isolamento) diversi di una stessa specie sono distinguibili solo sulla base di differenze antigeniche, visualizzate con prove in laboratorio in cui si usano sieri specifici contro determinate proteine del virus. Nel caso dell'herpes virus, l'herpes simplex, che causa herpes labialis, appartiene alla famiglia dell’herpes viridae, alla sottofamiglia α herpes virinae, il genere è herpes simplex virus, la specie è herpes simplex virus di tipo 1, diverso dal tipo 2, e infine il virus che infetta un individuo rispetto a un altro sarà il tipo o ceppo.

Tutti i virus ad RNA negativo, che sono varie famiglie, hanno l'involucro e nella maggior parte dei casi hanno un capside elicoidale; invece la maggior parte dei virus a RNA positivo hanno capside icosaedrico ed alcuni di questi possono essere dotati di involucro. I virus a RNA positivo hanno la capacità di legarsi direttamente al ribosoma per essere tradotti. I virus a RNA negativo invece non possono e quindi la prima cosa che devono fare appena entrano nella cellula è trascrivere un RNA con polarità positiva, complementare al loro genoma. La polimerasi virale non è mai presente nella maggior parte dei virus a polarità positiva, mentre la totalità dei virus a polarità negativa devono presentarla; l’RNA polimerasi è RNA dipendente perché nella cellula quest’enzima non esiste. Nella cellula esiste soltanto una DNA polimerasi DNA dipendente ed un RNA polimerasi DNA dipendente. (Si consideri che per DNA dipendente si intende una polimerasi che sintetizza un filamento complementare sulla base di un filamento di DNA, mentre il termine DNA indipendente indica un enzima che può trascrivere un filamento di RNA a partire da un'altra molecola di RNA).

I virus a DNA possono essere distinti in base alla forma del capside, che può essere icosaedrico, nella maggioranza delle volte, o elicoidale; inoltre anche la molecola di DNA è un ulteriore termine di classificazione; questa può essere, infatti, lineare, circolare, a singolo filamento o a doppio filamento.

 

Classificazione secondo Baltimore.

E’ una classificazione molto importante per capire i meccanismi di replicazione dei virus. Questa classificazione classifica i virus soltanto in base alla produzione di RNA messaggero. In questa classificazione i virus vengono divisi sulla base dei passaggi che devono seguire per produrre RNA messaggero.

La classe 1 comprende virus a DNA a doppio filamento. Il DNA a doppio filamento viene trascritto direttamente da una RNA polimerasi DNA dipendente nel nucleo. Appartengono a questa classe i poxvirus, gli adenovirus e gli herpes virus.

La classe 2 comprende virus a DNA a singolo filamento, che per l’uomo comprende soltanto i parvovirus. In questi virus la singola molecola di DNA appena entra nella cellula viene convertita, nel nucleo, in una molecola di DNA a doppio filamento e poi viene velocemente trascritta in RNA messaggero.

La classe 3 comprende virus a RNA a doppio filamento, uno di polarità positiva a l’altro di polarità negativa (reovirus). Questi virus, utilizzando una RNA pol propria che si portano dietro, possono copiare il filamento di RNA negativo in un RNA positivo, producendo direttamente un RNA messaggero. Questi virus della classe 3 devono quindi utilizzare una RNA pol virale per poter trascrivere un proprio RNA messaggero, mentre gli altri virus appartenenti alle prime due classi possono utilizzare la RNA polimerasi cellulare.

La classe 4 comprende virus a RNA a singolo filamento a polarità positiva, come il picornavirus ed altri. In questi virus l'RNA positivo è già un mRNA di per sé, e durante la replicazione questo RNA può produrre una molecola complementare di polarità negativa, da cui ristampa una molecola di RNA di polarità positiva, da utilizzare come messaggero. Questi virus sono dotati di una propria RNA pol RNA dipendente, in quanto quella endogena, essendo DNA dipendente, non può essere utilizzata per produrre un messaggero a partire da RNA.

La classe 5 comprende RNA a singolo filamento con polarità negativa (virus influenzale e rhabdovirus). Questi virus devono obbligatoriamente avere una RNA pol nel virione per poter produrre all’interno della cellula un filamento di RNA con polarità positiva da utilizzare come messaggero. (Si consideri che i virus a RNA devono quasi obbligatoriamente disporre di una loro RNA pol virale, perché le RNA pol endogene delle cellule animali infettate, hanno solo RNA pol DNA dipendenti e non RNA dipendenti. Solo i genomi ad RNA della classe 4 potrebbero anche non aver bisogno di queste RNA pol virali, in quanto sono a polarità positiva e potrebbero funzionare subito da messaggeri)

La classe 6 comprende un’unica famiglia, i retrovirus. I retrovirus hanno un genoma diploide di RNA con polarità positiva. Questo filamento di RNA viene trasformato, attraverso un enzima virale, la trascrittasi inversa, in una molecola di DNA, che poi viene convertita in una molecola a doppio filamento, la quale si integra nel genoma della cellula ospite e inizia ad essere trascritta. Alcuni mRNA andranno a costituire il genoma delle future particelle virali, e dovranno quindi uscire dalla cellula infetta.

La classe 7 comprende virus a DNA a trascrizione inversa, come il virus dell'epatite B. Questi virus hanno una molecola di DNA circolare incompleta, con una doppia elica incompleta nella sua elica di polarità positiva, che poi viene completata. Essi sono retrovirus al contrario, essendo a DNA usano la RNA pol DNA dipendente cellulare per formare mRNA. Per ricostituire il loro genoma a DNA questi virus utilizzano i loro messaggeri, ovviamente delle stesse dimensioni del genoma, ed attraverso una retrotrascrittasi virale a partire da mRNA viene riformato il genoma virale a DNA, che poi diviene circolare. L'epatite ha quindi una molecola circolare di DNA incompleta che prima di tutto viene completata. Questa molecola di DNA allo stato episomale, non integrato, viene trascritta e produce RNA messaggeri. Alcuni di questi messaggeri tramite trascrittasi inversa sintetizzano nuove molecole di DNA che poi diventano circolari; quindi, a partire da DNA circolare episomale, si produce un filamento di mRNA che poi viene riconvertito in DNA circolare.

 

Virus difettivi.

Esistono anche virus difettivi (mutanti per delezione) che non possono replicare se non in presenza di un virus helper, un virus che fornisce loro delle informazioni che si sono perse.

L'helper può essere o della stessa famiglia o anche un virus diverso. Esistono degli adeno-associati che si trovano solo durante infezione di adenovirus. Essi sono parvovirus, virus a DNAss che codifica per poche proteine.

I difettivi sono diversi da quelli che vengono chiamati virus satelliti. Nei difettivi si ha la presenza in natura di un virus identico al virus difettivo, mentre i virus satelliti sono quei virus che non presentano in natura un virus identico ad essi (quindi non esiste un virus analogo “completo”). Essi sono quindi entrambi difettivi ma la differenza sta nella presenza o meno in natura di un analogo virus selvatico o no. I satelliti quindi non hanno un virus wt dello stesso tipo.

Alcune malattie sono associate a questi virus difettivi o satelliti come il virus dell'epatite δ che è un virus satellite. Non esiste un virus δ wild type integro. Esso si replica solo in presenza del virus dell'epatite B e ne causa l'integrazione; la coinfezione di entrambi i virus da una forma più grave di epatite in quanto mentre il virus dell'epatite B permette la replicazione del virus δ, esso aumenta la replicazione del virus B.

Esistono anche i viroidi che infettano solo le piante. Essi sono formati solo da RNA nudo che non codifica per proteine che prendono dal loro ospite. I virusoidi sono anch'essi solo delle piante. Essi sono simili ai virus satelliti delle cellule animali. Usando i virus vegetali si possono infettare piante, così da dargli maggiori informazioni genetiche per fargli produrre proteine esogene. Sulla base di questo si cerca di creare delle piante che contengano antigeni di virus animali per fare delle vaccinazioni. La pianta transgenica è totalmente modificata e quindi può alterare l'ambiente mentre una pianta infettata dal virus è fine a se stessa perché, in questo modo, è impedita l'infezione tra pianta e pianta e la singola pianta produce proteine solo in quella generazione (senza trasmettere nulla alla progenie).

 

Virologia

 

Colture cellulari e titolazione                                                                           Lezione 3 del 05.11.07

 

Fasi di infezione virale.

Le cellule sono fondamentali per un virologo perché i virus sono parassiti intracellulari obbligati e  devono crescere all'interno di una cellula. La crescita può avvenire in vitro (come nei laboratori) ma per studi particolari si possono usare anche sistemi animali, quindi una crescita in vivo. I sistemi animali vengono usati o per virus molto difficili che non riescono a crescere facilmente o per studiarne i meccanismi patogenetici, cioè il modo in cui il virus provoca la malattia. Le cellule sono quindi fondamentali per poter studiare la replicazione dei virus.

La forma extracellulare di un virus è una forma metabolicamente inerte costituita da un genoma (RNA o DNA), da uno strato protettivo che può essere un capside ed anche un involucro, il quale deve legarsi ad una cellula attraverso un meccanismo che viene chiamato adsorbimento. Dopo l'adsorbimento abbiamo il meccanismo della penetrazione; quando il virus penetra incomincia il suo stato intracellulare metabolicamente attivo, che viene detto replicazione virale. Dopo l'entrata si ha una fase complicata e specifica in cui il virus deve liberarsi dei suoi strati protettivi denudando il suo genoma, il processo della spoliazione. Il genoma comincia quindi ad esprimersi ed a produrre mRNA, i quali porteranno alla sintesi di proteine, alcune delle quali serviranno per la replicazione del genoma. Il genoma così replicato va a costituire altre copie del genoma stesso che produrranno altri mRNA che porteranno ad una maggiore sintesi di proteine virali. Tra queste proteine virali ci sono proteine strutturali che andranno in qualche modo a ricoprire il genoma replicato per formare dei virioni completi di progenie. Una volta che i virioni di progenie si sono assemblati avremo la liberazione attraverso il rilascio di questi virioni, che ritornano ad essere metabolicamente inerti. Con questo processo un virus può formare migliaia se non milioni di copie identiche a se stesso. Per alcuni virus il rilascio è dato dalla lisi della cellula. La lisi avviene in due modi. In entrambi casi però lo stimolo è lo stesso: i virus, per poter rendere efficiente la sintesi delle proteine virali, hanno meccanismi che tendono ad inibire i fattori di traduzione della cellula, che quindi cessa la sua sintesi proteica. Questo chiaramente determina un danneggiamento cellulare (lisi) ma può anche essere uno stimolo di apoptosi. I virus che determinano apoptosi sono quelli più specializzati in quanto nelle vescicole apoptotiche il virus riesce ad evadere le difese dell'ospite. I virus rimangono coperti e nascosti dentro le vescicole endocitotiche senza essere rilevati dal sistema immunitario. Essi quindi non vengono bloccati da anticorpi e possono infettare altre cellule, come i macrofagi stessi in certi casi. Questo è quindi un meccanismo con cui il virus è in grado di evadere dalla cellula ospite.

 

Coltivazione dei virus animali.

Esse possono essere colture in vitro su tessuti o in vivo su sistemi animali.

Le colture cellulari, dato che possono facilmente essere maneggiate, non prevedono grossi ambienti, rappresentano quindi il metodo di elezione non soltanto per la loro praticità ma anche perché si possono applicare tante tecniche biochimiche e molecolari che non si possono fare su sistemi animali. La virologia moderna deriva tutta da studi fatti in vitro. Possiamo fare delle colture cellulari molto estese con miliardi di cellule, cosa che ci permette di coltivare una quantità enorme di virus che possiamo recuperare per studi successivi. Recuperare un virus serve per studiarlo dal punto di vista biochimico e molecolare, come lo studio del genoma e delle proteine.

I virus sono però anche la base di partenza per la costruzione di vaccini. I vaccini sono delle terapie che vengono effettuate con antigeni virali o batterici per far si che il nostro organismo monti una risposta immunitaria contro un patogeno. Il vaccino antinfluenzale viene fatto producendo quantità immense di virus tramite coltivazioni; questi virus poi vengono trattati in un certo modo ed infialati. Le colture cellulari ci permettono di fare un'infezione sincrona in modo che tutti i virus infettino le cellule contemporaneamente, così da poter studiare tutte le fasi e gli eventi biochimici e molecolari seguendo quello che avviene contemporaneamente in milioni di cellule.

Le condizioni chimico fisiche delle colture di tessuto sono sempre le stesse, ovvero condizioni standard. Le cellule possono essere coltivate in dischetti, dove, se sono in monostrato, aderiranno sulla superficie di questo pozzetto, oppure possono essere usate delle fiasche. La condizione fondamentale per far vivere queste colture cellulari è che questo materiale deve essere sterile dai batteri (chiaramente anche dai virus anche se essi sono di solito poco resistenti).

Le condizioni chimico fisiche sono date da un terreno di coltura definito in maniera standard. Ci sono vari terreni di coltura che rispondono ad esigenze diverse. In maniera schematica essi sono costituiti da una soluzione isotonica con sali monovalenti e bivalenti, contengono il glucosio come fonte energetica, contengono vitamine per facilitare il metabolismo delle cellule (coenzimi) e AA per la sintesi proteica, le basi azotate normalmente non vengono addizionate perché fatte dalle stesse cellule, il tutto a pH fisiologico di 7,3 mantenuto da un tampone di acido carbonico in equilibrio con anidride carbonica. Queste colture vengono effettuate in incubatori che, oltre a mantenere la temperatura a 37 gradi, immettono della CO2. L'anidride carbonica immessa al 5% negli incubatori può quindi scambiarsi con l'acido carbonico mantenuto nel terreno di coltura. Spesso viene anche addizionato siero per fornire fattori di crescita.

 

Linee cellulari.

Le linee cellulari possono essere di vari tipi. Negli ultimi 50 anni in cui sono state messe a punto le tecniche di coltivazione delle cellule in laboratorio sono state allestite molte colture cellulari. Esistono attualmente tre tipi di colture cellulari:

  • Le linee di cellule primarie che permettono l'isolamento di virus wild type; isolamento vuol dire avere un soggetto che ha una patologia e vedere se essa è dovuta ad un batterio o a un virus. Si prende un tampone faringeo che viene trattato con antibiotici e si cerca di isolare questo virus (se c'è) mettendo quello che deriva dal prelievo faringeo su delle colture primarie che sono molto sensibili. Coltura primaria vuol dire prendere da un animale dei pezzetti di tessuto specifico, disgregare questo tessuto tramite uso di proteasi e collagenasi, recuperare le singole cellule che formano questo tessuto e metterle in coltura. Queste colture primarie hanno vita breve e vivono per pochi cicli di replicazione, massimo 5-10 replicazioni per cellula.
  • Le linee di cellule diploidi da tessuto embrionale servono sempre per l'isolamento dei virus. Esse sono sempre colture primarie che però, invece di derivare da organismi adulti, derivano da embrioni. Esse hanno un potenziale di crescita superiore di circa 40-50 generazioni. Queste colture possono quindi essere anche subcoltivate: si prendono le cellule, si staccano dal substrato (se sono in monostrato) tramite enzimi proteolitici come la tripsina e le diluiamo; a questo punto le mettiamo in nuovi contenitori con terreni di coltura dove aderiscono e crescono per un certo numero di generazioni, 40-50 circa. Questo comporta un grosso dispendio di lavoro in quanto ogni volta che serve una coltura primaria o coltura di cellule diploidi bisogna sempre fare la procedura di estrazione vista prima del tessuto dall'animale o dall'embrione.
  • Le linee cellulari permanenti fatte da cellule che possono crescere sia in monostrato che in sospensione; tutte le cellule che derivano dai tessuti crescono solo in monostrato mentre quelle di origine ematica crescono in sospensione. Queste cellule sono in qualche modo trasformate. Ad esempio le cellule prelevate da topo spesso subiscono una trasformazione spontanea in cui le cellule diploidi diventano cellule permanenti a vita illimitata. Ci sono linee permanenti che sono state isolate 40 anni fa e che continuamente ancora oggi crescono nei laboratori di virologia. Oltre alle trasformazioni spontanee possiamo avere anche l'intervento dell'uomo che trasforma le cellule tramite virus oncogeni o agenti mutageni e cancerogeni che danno capacità di crescita illimitata. Alcune linee cellulari derivano infatti anche da linee tumorali umane e animali. Il loro comportamento anomalo è caratterizzato dal fatto che generalmente queste linee cellulari possono produrre tumori se inoculate in tessuti animali. Sono quindi delle cellule abnormi ma molto utili per la loro capacità di crescita illimitata. Per i virus vaccinali non vengono usate mai linee tumorali trasformate. Tutte le colture cellulari viste possono essere conservate congelate in adeguate condizioni in azoto liquido a -160 gradi.

 

Subcoltivazione delle cellule.

Le cellule in monostrato, per comodità, sono quelle più usate in virologia; esse aderiscono ad un substrato e quindi tendono a formare i così detti monostrati. Le cellule in sospensione sono invece cellule circolari sparse. Vediamo come vengono subcoltivate queste cellule. Nel caso delle cellule in sospensione si prende un'aliquota di sospensione e si trasferisce in un nuovo recipiente con terreno di coltura nuovo; queste cellule cominciano quindi a crescere in sospensione. Per le cellule in monostrato abbiamo il nostro recipiente con il nostro monostrato che è sempre sovrastato dal terreno di coltura (il terreno di coltura copre le cellule). Le cellule in questa condizione di monostrato fitto non possono sopravvivere in eterno ma hanno bisogno di essere subcoltivate. Esse non riescono a sopravvivere in eterno perché le cellule in monostrato crescono fino a quando ricoprono la superficie; alcune cellule, quando stanno una vicina all'altra, si bloccano per inibizione di contatto e quindi cessano di replicarsi. Alcune cellule tumorali riescono invece a crescere lo stesso al di là dell'inibizione da contatto. Sia con inibizione che senza (esempio cellule tumorali), le cellule soffrono perché scambiano con il terreno di coltura solo con la faccia superiore perché quella inferiore è attaccata al substrato e quelle laterali sono strettamente occupate dalle cellule. Le cellule tendono quindi ad essere affamate e per questo devono essere subcoltivate. Se abbiamo una coltura in monostrato, la trattiamo con una soluzione di tripsina ed EDTA: la tripsina è un enzima proteolitico che digerisce le proteine della matrice extracellulare che permettono l'adesione di queste cellule al substrato mentre l'EDTA è un composto in grado di chelare gli ioni bivalente, che sono importanti per i ponti ionici che si creano tra le cellule ed il loro substrato. Basta un trattamento di pochi minuti per staccare le cellule dal substrato. Una volta staccate, da rombi assumono una forma circolare. Queste cellule possono essere recuperate e centrifugate; una parte delle cellule viene messa in un nuovo recipiente con il suo terreno. Con il passare dei giorni si riformerà di nuovo il monostrato. Questo procedimento va effettuato circa due volte a settimana a causa del tempo di replicazione delle cellule. Nel caso di cellule umane il tempo è di 24 ore, le cellule murine si replicano ogni 12 ore mentre le cellule di hamster ogni 7-8 ore. In base al tempo di replicazione cellulare bisogna diluire diversamente per avere lo stesso risultato. Queste procedure vengono effettuate nelle cappe a flusso laminare (biohazard) che filtrano l'aria ambientale attraverso dei filtri e la immettono in maniera costante e laminare dentro delle cabine. Questo determina due grossi vantaggi. Uno è la sterilità: manipolando le colture di tessuto in queste cabine manteniamo la sterilità da batteri e muffe che non vanno ad inquinare la coltura di tessuto. Un batterio o muffa in una coltura determinerebbero la morte della coltura stessa. Esse inoltre assicurano la sicurezza in quanto il flusso di aria constante dall'alto verso il basso fa si che nulla entri (sterilità) ma anche che nulla esca (sicurezza).

 

Infezione di una coltura cellulare.

A partire dal nostro virus in sospensione questo può essere messo su una coltura cellulare. L'infezione è standardizzata: la sospensione virale viene stratificata sopra il monostrato, ovvero si elimina il terreno di coltura e si stratifica sopra le cellule la sospensione virale. I virus si attaccano alle cellule e penetrano all'interno di esse. L'adsorbimento avviene in maniera standard per un'ora a 37 gradi. Poi si rimuove la sospensione virale lavando i virus non penetrati, e si rimette su un nuovo terreno a 37 gradi aspettando cosa succede. Nel giro di ore o giorni (dipende dalla velocità di replicazione del virus) l'aspetto morfologico delle cellule cambia e va incontro a quello che viene definito CPE, effetto citopatico. Le cellule si arrotondano in quanto non hanno più proteine di adesione e proteine del citoscheletro che permettono l'adesione al substrato, e quindi tendono ad arrotondarsi e a staccarsi dal substrato, andando incontro a morte. L'aspetto morfologico viene quindi chiamato CPE. In questo caso la linea cellulare viene definita permissiva perché permette la replicazione del virus. In altri casi non si osserva nulla ed in questo caso si può dire che la cellula è resistente. Le cellule possono essere resistenti perché impediscono l'adsorbimento del virus in quanto non hanno sulla loro superficie le molecole (recettori) che permettono l'aggancio del virus. Possiamo avere anche cellule non permissive che mancano di un fattore necessario soltanto per la replicazione del virus, in genere un fattore che impedisce l'espressione del genoma virale.

 

Infezione di un sistema in vivo.

Se non lavoriamo in colture di tessuto possiamo lavorare in sistemi animali come in conigli, topi ed altri animali. Gli svantaggi sono: è un metodo costoso, non omogeneo, porta alla generazione di mutanti virali e da problemi etici. I vantaggi sono però quello di fornire informazioni sui meccanismi patogenetici delle malattie virali. Alcuni virus inoltre, come alcuni tipi di picornavirus, possono essere studiati solo su sistemi animali in quanto nessuna coltura riesce a sostenerne la replicazione. Un sistema animale in vivo particolare è quello dell'uovo embrionato, in cui abbiamo un uovo con un embrione di 8-10 giorni. L'uovo embrionato fornisce una quantità notevole di ambienti specifici dove possono replicare alcuni virus. Il virus influenzale cresce molto bene quando lo inoculiamo o nella cavità amniotica, se il virus deriva direttamente da un uomo, o, se il virus è già adattato, ovvero ha già fatto una replica nell'amnios, può crescere molto bene nella cavità allantoidea. Fare replicare il virus influenzale nella cavità allantoidea dell'uovo embrionato serve per la produzione del vaccino influenzale perché, in questo modo, si produce molto più virus che nelle colture tissutali. Se abbiamo una cellula resistente che non ha recettori per un certo virus, per alcuni virus possiamo isolarne il genoma e trasfettare le cellule. Questo funziona solo per alcuni virus, quelli che hanno genomi che possono esprimersi appena entrano nella cellula, come la maggior parte dei virus a DNA, e, per i virus a RNA, solo quelli a polarità positiva.

 

 

 

 

 

Titolazione per placche.

Oltre ai cambiamenti morfologici come l'effetto citopatico, possiamo anche fare un'analisi della quantità dei virus replicati. Possiamo adoperare delle tecniche che ci permettono di fare la titolazione virale, ottenendo quindi il titolo che è la quantità di virus prodotta da un tessuto; il titolo può essere diverso in base alla tecnica usata. Il titolo è comunque sempre dato in qualche unità su ml di sospensione virale. Ci sono vari metodi ma quello più importante è la titolazione per placche. Invece dei batteri e dei fagi qui si usano colture cellulari di tessuto e virus animali.

Si prende un monostrato cellulare e si infettano le cellule con la nostra sospensione virale. Per titolare il virus, la sospensione virale deve essere trattata in un certo modo poiché non conosciamo la quantità di virus che abbiamo in mano. Se abbiamo una piastra con diametro di 6 cm possiamo calcolare che, a livello di monostrato, possiamo avere da 5x105 a 5x106 cellule che formano il monostrato (in base alla dimensione delle cellule). Se da una cellula si formano mille o un milione di nuove particelle virali, possiamo avere numeri immensi come 5x108 virus, se vengono prodotti mille virus per cellula. Dalla nostra sospensione virale dobbiamo quindi fare varie diluizioni. Normalmente vengono operate diluizioni in base dieci. La diluizione 0 sarà 1 a 10, poi faremo 1 a 100, poi 1 a 1000 ecc... Con queste singole diluizioni andremo ad infettare delle repliche, cioè dei monostrati non infetti con le varie sospensioni virali diluite. Tutte verranno infettate un'ora a 37 gradi come abbiamo già visto. Successivamente si toglie l'inoculo virale e si mette sopra nuovo terreno in modo da far sviluppare il virus nelle cellule. Se mettiamo il nuovo terreno in forma liquida, i virus che sono entrati in queste cellule si replicano, e, quando vengono rilasciati nel mezzo, possono andare ad infettare anche cellule molto lontane sul monostrato. Il risultato sarebbe che dopo uno o due giorni avremo tutti i pozzetti uguali perché le cellule sarebbero state infettate tutte quante e quindi avrebbero tutte l'effetto citopatico. Anche le piastre con meno virus alla fine diventerebbero identiche alle altre perché il virus si diffonderebbe nel mezzo ed infetterebbe tutte le cellule. Bisogna quindi, dopo il periodo di adsorbimento virale, quindi dopo un'ora, aggiungere nuovo terreno di coltura reso semi-solido con l'aggiunta di addensanti come agarosio e metilcellulosa. Questo terreno semi-solido impedisce il salto di un virus da una cellula ad un'altra lontana. Il virus può quindi infettare solo cellule limitrofe e non cellule lontane. Durante il tempo di incubazione delle colture, dato che il virus si replica, sopra i monostrati si creano delle aree di lisi molto simili a quelle che avvengono con i batteriofagi sui batteri, solo che in questo caso sono cellule animali infettate e morte per infezione. Le varie zone di lisi possono essere rilevate facilmente colorando il monostrato con coloranti come il cristal-violetto. Le placche appariranno come aree perfettamente trasparenti, dato che le cellule sono morte. Per il saggio non si fa altro che contare le singole placche comparse sul monostrato, similmente ai batteri. Aumentando la diluizione diminuisce il numero delle placche dato che si riduce il numero di virus che hanno infettato il monostrato. Fare le diluizioni è importante in quanto così è possibile contare le placche, che altrimenti sarebbero centinaia. Contando il numero delle placche possiamo ottenere il titolo virale. Conoscendo il volume iniziale della sospensione virale che abbiamo fatto adsorbire possiamo determinare il titolo virale. Il titolo virale si ottiene facendo la media delle placche di lisi ottenute con le varie diluizioni. Infine, dato che generalmente si infetta con 0,5 ml di sospensione virale, il titolo virale ottenuto sarà moltiplicato per due (dato che la concentrazione è in ml), che poi verrà moltiplicato per l'inverso dell'ultima diluizione che forma placche (esempio 10-8 quindi moltiplichiamo per 108). L'unità è il PFU (unità formante placca)/ml. Questa è quindi la titolazione per placche.

 

Titolazione per diluizione limite.

Un altro metodo meno preciso ma molto utile per titolare vari campioni è quello della diluizione limite. Questo metodo prevede che ad ogni diluizione si infetti un numero maggiore di repliche di monostrati. Esempio: se infettiamo venti pozzetti con diluizione a 10-3; poi altri venti pozzetti con diluizione 10-4 ecc.. Dopo il periodo di adsorbimento di un'ora a 37 gradi rimettiamo il terreno liquido perché vogliamo che il virus si replichi ed infetti il più possibile il monostrato, anche le cellule lontane. Dopo aver aspettato due tre giorni possiamo aspirare il terreno e colorare i monostrati con il cristal-violetto e vedere i pozzetti in cui il virus si è replicato, ovvero i pozzetti che appaiono trasparenti mentre dove il virus non si è replicato le cellule continuano ad esserci e si colorano in blu. A seconda delle diluizioni si può vedere in quali pozzetti il virus si è andato a replicare. Con l'aumentare delle diluizioni saranno minori i pozzetti non infettati. A questo punto possiamo determinare il titolo in base alle percentuali dei pozzetti che si sono infettati. Il titolo del virus viene dato usando una formula che si basa su un metodo statistico. Prima però bisogna calcolare l'H dato dalla percentuale superiore al 50% dei pozzetti infetti meno 50% diviso la percentuale superiore al 50% di pozzetti infetti meno la percentuale inferiore al 50% di pozzetti infetti, che da un certo risultato. Ottenuto l'H, il titolo virale si ricava usando questa formula: T=10Hx(10inverso della diluizione maggiore del 50%). Il titolo è dato in unità di virus che danno l'effetto citopatico nel 50% delle colture. Questa titolazione è molto meno precisa ma serve per campioni numerosi. L'unità di misura è CPE50% su ml. Tutte e due le tecniche viste prevedono che il virus sia infettante e che quindi le cellule siano permissive. Non tutti i virus che escono fuori da una cellula sono infettanti perché possono perdere parti della loro struttura, del loro genoma, non vengono assemblati correttamente ecc. Queste tecniche ci danno quindi solo il numero di virioni infettanti.

 

Titolazione tramite microscopia elettronica.

Altri metodi fisici di misura dei virioni sono quelli che usano la microscopia elettronica, mescolando la sospensione virale con delle particelle di latex (un polimero) ed osservandole al microscopio elettronico. Facendo un mescolamento di particelle di latex note con virus, si contano quanti virus ci sono su quante particelle latex e si arriva ad un numero approssimativo.

Usando questo metodo ci si è accorti che non è detto che un'unità formante placca corrisponda ad un virione. Facendo la titolazione delle placche e confrontandola con la conta delle particelle virali rispetto alle particelle di latex, si è visto che la PFU non è rappresentata da un unico virione ma, per avere un'infezione buona e produttiva, serve un maggior numero di virioni che colpiscano la stessa cellula. Nel caso del poliovirus (appartenente alla famiglia dei picornaviridae) il rapporto particelle PFU è di 30-1000, quindi per fare un'infezione produttiva servono 30 virioni che colpiscono contemporaneamente la stessa cellula; per il virus influenzale è 20-50 ecc.. (non bisogna sapere questi numeri).

 

Titolazione per emoagglutinazione.

Un'altra tecnica di titolazione che può essere usata solo per alcuni virus, come gli influenzali (orthomyxovirus) ed i parainfluenzali (paramyxovirus), è quella della emoagglutinazione. Con microscopia a scansione vediamo globuli rossi con virus influenzali sulla loro superficie. Alcuni virus hanno la capacità di riconoscere attraverso proteine presenti sulla loro superficie, delle molecole presenti sui globuli rossi, in particolare l'acido sialico di cui i globuli rossi sono molto ricchi. Questi virioni, potendo interagire con gli eritrociti, agglutinano e quindi tengono vicino a se più eritrociti agglutinandoli. Possiamo quindi usare questa tecnica per titolare questi virus. In delle piastre con pozzetti ad U si distribuisce prima un tampone dello stesso volume, es. 100 microlitri; poi prendiamo 100 microlitri della nostra sospensione virale effettuando quindi una diluizione 1 a 2. Agitiamo per rendere omogenea la diluizione, e prendiamo 100 microlitri del primo pozzetto trasferendoli nel secondo pozzetto, così da fare una diluizione 1 a 4; così si continua facendo altre diluizioni di due. Dopo le diluizioni si aggiungono in tutti i pozzetti 100 microlitri di emazie allo 0,5% (emazie di pollo, di coniglio o umane di gruppo 0 RH negativo). A questo punto bisogna attendere che questi eritrociti sedimentino in base alla forza di gravità. Se il virus non c'è, gli eritrociti sedimentando andranno a sbattere contro le pareti del pozzetto a U, formando un bottoncino in fondo al pozzetto. Se il virus c'è, esso farà un reticolo di emazie che darà l'agglutinazione dei globuli rossi. Il pozzetto appare quindi in questo caso omogeneamente colorato in rosso e non si avrà solo un puntino in fondo. Questa è una tecnica macroscopica che in un'ora permette di titolare il virus, anche se può essere usata solo per i virus che causano agglutinazione delle emazie. Le diluizioni sono ravvicinate (in base due piuttosto che dieci) ma, affinché avvenga il fenomeno dell'agglutinazione, è stato calcolato che è necessaria la presenza di almeno 105 virioni. Lo scarto è quindi abbastanza grande, cosa che da poca precisione al metodo. Il titolo, in questo caso, viene dato in HU/ml ed è dato dall'inverso dell'ultima diluizione in cui si osserva l'agglutinazione. Un ulteriore uso della capacità dei virus di legare le emazie ci permette di vedere quali sono le emazie infette da questi virus. Molte delle glicoproteine virali, tra cui quelle che causano l'emoagglutinazione (la HA, emoagglutinina), prodotte durante il ciclo di replicazione virale vengono esposte sulla superficie della cellula infetta permettendo appunto questo fenomeno. L'agglutinazione ci permette di vedere anche come alcuni virus non hanno un grosso rilascio dalle cellule infette.

 

(Si ringrazia Alex S. per la revisione)

 

Virologia

 

Adsorbimento, penetrazione e spoliazione                                                       Lezione 4 del 08.11.07

 

Ciclo unico di replicazione.

Con le tecniche di titolazione viste l'altra volta è possibile studiare un virus costruendo il così detto ciclo unico di replicazione (one step growth) che si attua infettando un monostrato di cellule con una quantità di virus abbastanza rilevante, quantità indicata come molteplicità di infezione, “moi”. Se noi infettiamo ogni singola cellula del monostrato con 10 PFU (10 unità formanti placca di lisi), otteniamo in tutta la popolazione un'infezione grosso modo sincrona; possiamo quindi seguirla con più facilità. Se a tempi determinati andiamo a calcolare il titolo virale che troviamo nella coltura sia nel terreno che nelle cellule, possiamo costruirci una curva di crescita; curva analoga alla curva di crescita dei batteri si può fare anche con i virus seppure, in questo caso, la curva ha un andamento leggermente diverso. In questo caso seminiamo i virus su cellule ed il titolo è il numero dei virioni. Così ci accorgiamo che subito dopo l'adsorbimento del virus si ha la diminuzione e quasi la scomparsa dei virioni titolabili; dopo un certo periodo che dipende dalla velocità di replicazione del virus abbiamo la crescita del titolo virale che indica la replicazione del virus.

Dopo aver fatto la nostra infezione su monostrato vediamo come il titolo virale scende fino ad arrivare alla totale assenza di virioni infettanti in quanto, una volta che i virioni sono entrati nella cellula, rilasciano le loro componenti all'interno della stessa, in particolare il genoma, perdendo così la capacità di infettare. Quando il virus è ridotto solo a genoma, questo virione non è più infettante e quindi il titolo del virus diminuisce fino ad andare a zero. Questa è la fase precoce senza virus infettanti. Fino a che non si ha la replicazione del genoma ci troviamo nella fase precoce in cui non abbiamo nessun virus infettante. Il ciclo di replicazione del virus va avanti giungendo alla fase tardiva che continua ad avere assenza di virioni infettanti ma solo all'inizio. Tutto il periodo di tempo dall'adsorbimento fino a poco prima che i virioni comincino a replicarsi viene detto periodo di eclisse, ovvero il periodo dove non si rilevano virioni infettanti (che comprende la fase precoce e parte della fase tardiva). Il periodo di eclissi termina quando si incomincia a rilevare virioni infettanti sia a livello delle cellule che a livello del terreno.

A livello delle cellule leviamo il terreno che sovrasta il monostrato, prendiamo il monostrato, congeliamo le cellule rompendole, scongeliamo e ricongeliamo (quindi 2 volte), centrifughiamo i virus cellulari in ultracentrifuga ed il supernatante che si forma si usa per fare la titolazione, che mostra come abbiamo all'interno delle cellule la comparsa di virioni, cosa che comporta la fine del periodo di eclissi. Possiamo andare a titolare anche il virus nel terreno in quanto esso, ad un certo punto, esce dalle cellule ed il titolo nel terreno aumenta. L'inizio del rilascio del virus indica la fine del periodo di latenza (diverso da periodo di eclisse!). La differenza tra la quantità di virus inoculata con cui abbiamo infettato il monostrato e la quantità di virus che abbiamo nel terreno si chiama resa e ci da un'idea di quanto virus viene prodotto da una singola cellula. Se un virus infettante compare prima all'interno delle cellule e dopo nel supernatante, questo accade perché il virus si accumula nelle cellule e poi viene rilasciato all'esterno con meccanismi che vedremo. Se invece avessimo una curva dove non riusciamo mai ad avere virus intracellulare ma abbiamo solo virus extracellulare questo può indicare che il virus si forma in un punto della cellula esterno, a livello della membrana cellulare, con il processo di gemmazione (budding).

 

Ciclo di replicazione di un virus.

Abbiamo varie fasi: all'inizio abbiamo il riconoscimento della cellula target, l'adsorbimento a cui segue una penetrazione, chiaramente solo se la cellula è permissiva e se il virus è infettante. In seguito abbiamo la fase di “uncoating” ovvero di spoliazione, in cui dalla struttura del virus si arriva all'esposizione e quindi alla spoliazione del genoma virale. Questo genoma deve trascrivere ed esprimersi, i trascritti vengono tradotti dai ribosomi che permettono quindi la replicazione del virus (sia genoma che proteine formate) che si riforma in molte copie per autoassemblaggio. I virioni formati possono quindi uscire dalla cellula tramite i meccanismi di gemmazione o di lisi che rilasciano la progenie.

 

Adsorbimento e penetrazione.

Tutti i virus animali devono penetrare la membrana citoplasmatica e devono quindi avere meccanismi per permettere questo passaggio. Altri virus come quelli delle piante, oltre alla MP devono attraversare anche la parete cellulare. I virus vegetali vengono di solito o iniettati attraverso punture di insetti o tramite rotture della loro struttura. Poi attraverso i plasmodesmi possono diffondere da cellula a cellula. Anche i batteri hanno parete cellulare ma i batteriofagi riescono a penetrarla. La parte più esterna dei virus può essere solo proteica, e quindi capside (virus nudo), oppure può esserci anche un involucro. La struttura del virus determina quindi il meccanismo principale attraverso cui il virus può entrare nella cellula. L'adsorbimento avviene attraverso il riconoscimento da parte di una proteina che si trova nella parte esterna del virus, detta VAP (virus attachment protein), che si lega ad una proteina della cellula. Questa interazione all'inizio è elettrostatica ma l'attacco è molto forte in quanto il virus si lega a tante proteine tramite le sue VAP. A 4 gradi di temperatura un virus può legarsi ma non penetrare a causa della membrana che diventa più rigida e immobilizzata. L'interazione da elettrostatica diventa poi idrofobica, così che il virus prenda contatto con la parte lipidica della membrana. La presenza o no della proteina recettoriale della VAP determina la permissività della cellula: una cellula senza la proteina riconosciuta dalla VAP non può essere infettata; questo indica quindi il tropismo del virus. Ci sono virus che in vitro infettano tutti i tipi di cellule ma, quando sono in vivo, infettano solo alcune cellule in quanto le cellule del corpo sono differenziate rispetto a quelle coltivate in vitro, le quali tendono a sdifferenziare. Questo riconoscimento può essere determinante per alcune patologie. Il tropismo può quindi essere tissutale o specie-specifico.

 

Vap e recettori.

Un esempio di VAP è la HA degli orthomyxovirus (virus influenzale). L'HA sta per emoagglutinina ed è la stessa proteina che permette l'aggancio dei virus influenzali ai globuli rossi che ci permette di isolare questi virus anche per emoagglutinazione. Questa proteina è formata da due subunità, una HA1 ed una HA2 le quali derivano dal clivaggio di un unico precursore, HA0, che è quello sintetizzato dal genoma. Una proteasi, chimotripsina like, a livello della cellula infettata cliva la proteina HA0 nelle sue subunità, che rimangono legate insieme da ponti disolfuro. La vera VAP del virus influenzale è costituita da trimeri di questo complesso proteico. In questo complesso proteico possiamo identificare una parte esterna globulare di HA1 e poi abbiamo una parte fibrosa, essenzialmente HA2. La subunità HA1 non è una proteina intramembranale, mentre la HA2 è una proteina intramembranale che permette l'aggancio della proteina all'involucro del virus.

I rhinovirus (virus del raffreddore), appartenenti alla famiglia dei picornaviridae, hanno una VAP detta VP1, localizzata ai vertici dell'icosaedro che forma il pentone. Gli adenovirus usano la proteina 3 (fiber protein) che forma delle fibre proteiche mentre i paramyxovirus usano la proteina HN.

Vediamo quali sono le strutture a livello della MP che possono fungere da recettori per il virus. Essi sono fondamentalmente di poche specie chimiche come lipoproteine, glicolipidi o glicoproteine.

Una catena carboidratica molto usata è l'acido sialico, un polimero di N acetil-glucosammina che è la parte terminale delle glicoproteine. Questo acido sialico è proprio il recettore di molti virus. Molti virus usano questa struttura in quanto, essendo la parte terminale di molte glicoproteine, assicurano al virus la possibilità di riconoscere sempre un recettore su una qualsiasi cellula, dato che tutte le cellule lo possiedono. L'acido sialico è però in genere specifico per i virus influenzali che possono essere umani, bovini, suini, ovini ed aviari. I virus umani si pensava fossero in grado di riconoscere solo un acido sialico legato ad un catena glicidica con legame α2-6, mentre i virus aviari erano in grado di riconoscere soltanto acidi sialici legati alla catena glicidica della glicoproteina con un legame α2-3. Questo quindi permetteva di avere un diverso spettro d'ospite tra virus umani e aviari. Il mutante aviario ha però acquisito la capacità di riconoscere anche l'acido sialico con legame α2-6. Il tropismo dipende, quindi, in questo caso, dal tipo di legame dell'acido sialico. L'acido sialico viene usato anche dai coronavirus (esempio il virus della SARS) e dai reovirus ed in particolare i retrovirus.
Altri virus usano recettori molto specifici come il virus del morbillo che usa soltanto il  recettore cd26 ed il recettore detto SLAM presente nei linfociti B e T ed in alcune cellule neuronali. Il poliovirus usa invece come recettore una proteina detta PVR che viene riconosciuta dalla VP1.

I rhinovirus (famiglia dei picornaviridae) usano invece la proteina ICAM-1 che è una proteina di adesione intercellulare.

Dal punto di vista strutturale questi recettori o sono carboidrati o molecole proteiche molto specifiche. Generalmente la morfologia di queste molecole ha una struttura simile alle IgG. Abbiamo virus che invece di usare una sola proteina ne usano di più, come il caso dell'adenovirus che come VAP usa la proteina 3, che costituisce le fibre di questo virus. La proteina 3 (fiber protein) prende contatto con il suo recettore CAR ma questo non è sufficiente per fare penetrare il virus in quanto è necessario che la base dei pentoni con le loro proteine (presenti ai vertici dell'icosaedro), prendano contatto con delle integrine. Solo in questo modo il virus acquisisce quelle interazioni idrofobiche che inducono un meccanismo di endocitosi che permette la penetrazione. Queste proteine cellulari accessorie usate dai virus vengono chiamate corecettori.

Un altro caso di uso di corecettore ce lo fornisce il virus HIV. Sulla superficie lipidica di questo virus abbiamo due proteine, un complesso proteico formato da una proteina esterna detta gp120 e da una proteina intramembranale detta gp41, che permette il mantenimento della struttura dell'involucro virale. La gp120 è la VAP che riconosce il cd4 come suo recettore specifico. Questo riconoscimento induce un cambio conformazionale della gp120 che è in grado, a questo punto, di riconoscere un corecettore che è formato da due tipi di molecole CXCR4 (più sui linfociti T helper) e CCR5 (più sui macrofagi che sono il target iniziale del virus) che sono recettori che si trovano sulle cellule del sistema immunitario, nello specifico sono recettori per le chemochine. Quando un soggetto viene infettato dall'HIV le prime cellule ad essere infettate sono i macrofagi in quanto la gp120 è naturalmente portata a riconoscere come corecettore naturale il CCR5. I macrofagi sono cellule molto resistenti a queste infezioni e quindi il virus può replicarsi molto al loro interno. La gp120 durante la replicazione, a causa della mancata precisione delle polimerasi virali, acquisisce delle mutazioni che gli permettono di riconoscere il CXCR4 così da poter infettare anche i linfociti T, fino al declino del sistema immunitario che porta all'AIDS conclamato. Il cambio conformazionale della gp120, dato dal legame con il recettore, espone la proteina gp41 la quale ha una sequenza AA di circa 20 AA idrofobici (peptide fusogeno) che penetrano nella membrana della cellula e, tramite cambiamenti conformazionali, ovvero dei ripiegamenti, avvicina le due membrane (quella virale e quella cellulare) permettendo la penetrazione del genoma del virus attraverso il meccanismo di fusione.

 

Meccanismi di penetrazione.

I meccanismi di penetrazione possono essere di cinque tipi:

  1. I virus nudi possono penetrare con meccanismi di penetrazione quasi diretti ancora non ben noti. Possiamo avere il caso in cui il virione integro penetra attraverso la membrana citoplasmatica per raggiungere il nucleo (solo i parvovirus);
  2. Per quanto riguarda i picornavirus, questi hanno un meccanismo di penetrazione diretto dove il capside virale rimane all'esterno e penetra all'interno soltanto il genoma del virus.
  3. Altri virus, come l'adenovirus, i togavirus ed i reovirus, adsorbono e penetrano nella cellula in vescicole di clatrina che poi diventano endosomi fino alla spoliazione.
  4. I virus con involucro generalmente penetrano con un meccanismo di fusione, in cui usano l'involucro per fondere. La fusione può essere sulla membrana citoplasmatica come abbiamo visto con l'HIV ma anche nei paramixovirus e negli herpes simplex virus in cui penetra solo la parte più interna del virus e non l'involucro;
  5. Oppure avviene un'endocitosi come nel caso precedente, ma solo nell'endosoma si ha la fusione e la liberazione della parte interna del virus, come nel caso del virus influenzale.

 

1) I parvovirus sono gli unici virus che entrano nella membrana citoplasmatica integri ed arrivano integri anche nel nucleo. Sono virus molto piccoli di diametro, circa di 18-26 nm e quindi possono penetrare attraverso i pori nucleari. A livello della membrana nucleare si libera il genoma di questo virus che appartiene alla classe II di Batimore (virus a DNAss). Una proteina che deve penetrare attraverso una membrana nucleare deve avere una sequenza di localizzazione nucleare (NLS) caratterizzata da una sequenza amminoacidica precisa, posseduta dalla VP1 del capside virale. Questo virus, una volta giunto presso la membrana nucleare, può penetrare attraverso meccanismi di importo nucleare classico.

 

2) I picornaviridae, come il rhinovirus (virus a RNA a polarità positiva ss) penetrano con un meccanismo che possiamo annoverare all'endocitosi anche se è molto particolare. Il pH esterno alla cellula è un pH neutro e quindi la penetrazione è pH indipendente. Nei picornaviridae abbiamo i pentoni con VP1 (che è anche la VAP del virus) mentre sulle facce dell'icosaedro abbiamo la VP2 e la VP3. Sulla faccia interna del capside abbiamo la proteina VP4 che serve a collegare tra loro le varie proteine che formano le facce dell'icosaedro; la VP4 è, quindi, una proteina “collante”. Il virus nella sua struttura inerte ha un coefficiente di sedimentazione di 160S. Quando prende contatto con il suo recettore (esempio ICAM nel rhinovirus) abbiamo un cambio di struttura, cosa che si è notata perché le particelle acquisiscono una sedimentazione di 180S, per questo sono state chiamate particelle A. Nel cambio conformazionale il contatto di VP1 con il suo recettore cellulare ha in qualche modo cambiato la struttura della proteina inducendo cambi conformazionali in tutte le altre proteine del capside del virus; questo di fatto induce il distacco della VP4 dalle altre proteine; la struttura quindi diventa meno densa e più rilassata a causa della perdita della VP4. Si suppone che questo parziale disassemblaggio permetta la fuoriuscita del genoma del virus dal capside. Si è anche visto che le particelle A, con questi cambi conformazionali, fanno esporre alla VP1 dei residui idrofobici in grado di creare dei canali (quindi pori) nello strato lipidico della membrana cellulare. Quindi la VP1 può anche fungere da proteina motore, ed è in grado di fare uscire l'RNA dalla struttura capsidica virale: questo può avvenire o a livello della membrana citoplasmatica o a livello degli endosomi. L'endocitosi quindi non è per forza necessaria: abbiamo o endocitosi o fuoriuscita del genoma nel citoplasma senza endocitosi.

 

3) Meccanismi di endocitosi vera e propria esistono e coinvolgono direttamente l'endosoma. Il primo virus in cui si è notato questa dipendenza stretta dall'endocitosi è il togavirus, virus con envelope e glicoproteine che, a livello di struttura, prendono contatto direttamente con il nucleocapside icosaedrico. Si è visto attraverso studi di microscopia elettronica che il virus, per poter diventare infettante, doveva subire una penetrazione attraverso vescicole endocitotiche, unico luogo dove il genoma viene rilasciato. Gli endosomi sono delle strutture cellulari che normalmente servono per il riciclaggio di alcune componenti della membrana citoplasmatica; essi si formano a partire dalle vescicole di clatrina che subiscono un processo di maturazione dove possiamo identificare inizialmente un endosoma precoce che mantiene un pH intorno a quello fisiologico;  con la maturazione dell'endosoma si ha un abbassamento del pH per attivazione di una pompa protonica; gli endosomi diventano quindi tardivi con pH intorno a 4,5. In questa fase l'endosoma può o fondersi con il lisosoma per formare l'endolisosoma oppure può fondersi ed andare a far parte delle vescicole del trans-golgi che servono per la maturazione di glicoproteine endocellulari. Molti virus usano questo meccanismo cellulare per la loro penetrazione e spoliazione. I virus, con questo meccanismo di endocitosi, raggiungono spesso il sito dove dovrà avvenire la replicazione del virus.

Nell'endocitosi del togavirus abbiamo l'adsorbimento del virus sulla membrana. La cellula reagisce e forma la vescicola di clatrina che poi diventa un endosoma; a livello dell'endosoma si ha la fusione dell'involucro virale con la membrana dell'endosoma, pH dipendente (acido), dove si ha il rilascio del nucleocapside centrale a livello del citoplasma.

Altri virus usano l'endosoma per altri scopi, come gli adenovirus che vengono anche loro endocitati. L'abbassamento del pH dell'endosoma determina un distacco delle fibre dalla base dei pentoni (localizzati ai vertici), che fa perdere la proteina 3 a causa di cambi conformazionali indotti dal pH acido. Le proteine che stanno ai vertici espongono degli AA idrofobici, che lisano la membrana dell'endosoma rilasciando un capside pseudo-disassemblato nel citoplasma.

I reovirus, a cui appartiene il rotavirus, utilizzano anche loro gli endosomi ma, a differenza degli altri virus che si fondono prima che l'endosoma diventi endolisosoma, essi, avendo tre capsidi concentrici uno sull'altro, arrivano all'endolisosoma che, avendo enzimi proteolitici, permette la digestione del capside più esterno.

 

4) I virus con involucro usano invece la fusione che si definisce a pH neutro, se avviene sulla membrana della cellula, o pH acido se avviene sugli endosomi. A pH neutro l'involucro virale rimane nella membrana citoplasmatica mentre il capside entra. Nella fusione pH dipendente il virus integro viene intrappolato nell'endosoma e l'abbassamento di pH determina cambiamenti conformazionali che permettono la fusione. Un meccanismo di fusione già visto è quello del virus HIV. Il legame di gp120 con il cd4 induce un cambio conformazionale e si può quindi avere il legame con il corecettore delle chemochine che induce l'esposizione della gp41 e quindi la fusione.

Altri virus usano meccanismi simili ma con strutture diverse come nel caso del virus herpes simplex. Questi virus sono a DNA a doppia elica lineare racchiusi in un capside icosaedrico con involucro ma senza proteine di matrice. Sull'involucro questi virus presentano fino a 11-12 glicoproteine, cosa che indica una penetrazione complessa. Due proteine servono per l'adsorbimento. La gC (VAP) interagisce con l'eparansolfato (un glicosamminoglicano)  ma importante per l'adsorbimento è anche il riconoscimento da parte della  glicoproteina D (gD) di un corecettore che può essere di diversi tipi, cosa che implica la capacità di questo virus di infettare cellule diverse. Altre glicoproteine mediano l'entrata e quindi la penetrazione. Una volta attaccato alla membrana, il complesso glicoproteico fonde le due membrane (del virus e della cellula) e fa penetrare il capside virale all'interno del citoplasma. Il meccanismo di fusione è dovuto sempre a cambi conformazionali: le proteine subiscono una distorsione come se si piegassero avvicinandosi.

Virus che fanno fusione dall'esterno a pH indipendente, in maniera più specializzata, sono i paramixovirus. Essi sono virus con genoma a RNA a polarità negativa con capside elicoidale; è presente anche una RNA pol RNA dipendente formata da due proteine, la L e la P. Il nucleocapside è circondato da un involucro in cui è presente nella parte interna la proteina M di matrice ed uno strato lipidico con due diversi tipi di glicoproteine: abbiamo la VAP, HN (H= emoagglutinina; N= neuraminidasi con le stesse funzioni viste nel virus influenzale seppure in questo caso sono unite) che riconosce l'acido sialico e conferisce la capacità di emoagglutinazione. Oltre alla HN che è presente sulla superficie in tetrameri, abbiamo anche dei trimeri della proteina F (F sta per fusione) che serve appunto per la fusione. La proteina F viene sintetizzata dal virus come unico precursore F0 similmente a quello dell'HA del virus influenzale. Quando questa proteina arriva sulla membrana della cellula, attraverso un taglio proteolitico si trasforma in un complesso formato da una proteina F1 e da una F2, tenute insieme da ponti disolfuro. Il taglio proteolitico determina l'esposizione di una sequenza interna che è una sequenza di AA idrofobici, simile a quella presente nella gp41 del virus HIV, che permette a questa proteina di rimanere più esposta sulla superficie del virus. I paramixovirus sono una famiglia numerosa a cui appartengono molti virus che danno molte malattie diverse come influenza, morbillo ecc... quindi ci deve essere un meccanismo che li renda specifici. I tetrameri di HN ed i trimeri di F sono associati da un punto di vista spaziale in maniera molto ravvicinata, quando l'HN riconosce il suo recettore, si ha come un allontanamento dell'HN da F che causa l'attivazione della proteina F. Essa, attraverso il peptide fusogeno, si inserisce sulla membrana citoplasmatica permettendo l'avvicinamento delle due membrane e la loro fusione con la fuoriuscita del nucleocapside del virus.


5) Il virus influenzale (figura nella pagina prima) usa invece una fusione pH dipendente (acido). Questo virus presenta all'interno la struttura nucleocapsidica con genoma a RNA a polarità negativa ss ma il genoma, invece di essere un'unica molecola di RNA, è segmentato. Ogni gene è quindi un pezzetto di RNA, e ogni pezzetto di RNA è racchiuso in un capside elicoidale, quindi avremo 7-8 nucleocapsidi che formano il genoma del virus. Questi nucleocapsidi sono racchiusi da un involucro con le glicoproteine, spikes, HA in trimeri (emoagglutinina) e NA in tetrameri (neuraminidasi, enzima che scinde il recettore dell'acido sialico) poste nello strato lipidico. NA è importante per la penetrazione in quanto il virus deve infettare le vie respiratorie. Le vie respiratorie hanno il muco come meccanismo di protezione ma, la presenza di NA, permette a questo virus di staccarsi quando si lega ad una mucoproteina. La stessa funzione della NA è presente anche nei paramixovirus che hanno però un'unica proteina HN, con le funzioni sia di HA che di NA. La VAP del virus è formata da un trimero di HA, formato dalla due subunità HA1 e HA2, con HA2 che sarebbe il peptide fusogeno. Nella sua forma a pH neutro la proteina HA2 ha una conformazione con tre domini α elica ed un dominio più rilassato a foglietto β. Quando il pH cambia nell'endosoma e diventa acido, si ha il passaggio di pH acido anche all'interno del virione attraverso un'acidificazione mediata da dei canali ionici che si formano sulla membrana del virus a partire dalla proteina M2. Questo cambio di pH determina il cambio conformazionale della zona rilassata che diventa da foglietto β ad α elica, cambiando la conformazione della proteina. Il peptide fusogeno, che prima era ripiegato nella sua struttura proteica, a questo punto viene esposto e si va ad inserire nella membrana target. Siccome questa formazione non è molto stabile ma ha bisogno di molta energia, la proteina tende a riacquisire la forma iniziale; questa proteina, tendendo quindi a ripiegarsi, permette l'avvicinamento intimo tra le due membrane. Sostanze che bloccano la proteina M2 inibiscono la penetrazione del virus influenzale come l'amantadina (altamente specifica per i canali ionici M2 virali ma che non ha effetto sui canali cellulari H+/ATPasi).

 

Spoliazione.

Subito dopo la penetrazione in maniera coordinata avremo la spoliazione, ovvero il rilascio del genoma del virus a livello del sito di replicazione. Per quanto riguarda gli adenovirus, attraverso gli endosomi il virus penetra per endocitosi e può essere trasportato verso il nucleo che è la sede di spoliazione e replicazione, essendo un virus a DNA. Il cambio di pH determina il distacco delle fibre, il disassemblaggio parziale del capside e la lisi degli endosomi. Il capside disassemblato, tramite i microtubuli raggiunge il poro nucleare dove subisce un unfolding finale e rilascia il genoma del virus, DNA lineare a doppio filamento. Il processo di penetrazione è quindi associato anche alla spoliazione. Nel giro di 20-30 minuti il virus inietta il suo DNA a livello del nucleo dove inizierà la sintesi.

Vediamo la spoliazione del virus influenzale. La penetrazione è pH dipendente come abbiamo visto prima. Avremo la fusione dei nucleocapsidi a livello del citoplasma; questi nucleocapsidi poi si legano al sistema microtubulare e giungono presso il nucleo. Mentre l'adenovirus è troppo grande per entrare nel poro nucleare, i nucleocapsidi del virus influenzale possono penetrare direttamente essendo piccoli ed elicoidali. Sia nel caso degli adenovirus che nel caso dei complessi nucleoproteici del virus influenzale, le proteine presenti nei capsidi devono avere delle sequenze di localizzazione nucleare altrimenti non potrebbero dirigersi verso il nucleo. La replicazione avviene quindi nel nucleo per entrambi anche se i virus a RNA di solito non replicano nel nucleo, eccezione il virus influenzale che seppure a RNA replica nel nucleo. La proteina M, oltre ad essere la proteina di struttura dell'involucro virale, permette anche il collegamento tra involucro virale e struttura interna dei nucleocapsidi. Quando si ha la fusione, la proteina M1 rimarrebbe collegata al nucleocapside ma il cambio di pH determina il distacco della proteina M1 dal nucleocapside ed espone la proteina nucleocapsidica (NP), che contiene le sequenze NLS che permettono la localizzazione e l'importo nucleare dei nucleocapsidi. Per ricapitolare: l’evento chiave per la spoliazione dei genomi del virus influenzale è la dissociazione pH-dipendente tra la proteina di matrice M1 ed i complessi RNP (ribonucleoproteici). A questo punto i complessi RNP sono sufficientemente piccoli per traslocare attraverso i pori nucleari.

Tutti i virus a DNA replicano nel nucleo, eccezione il poxvirus (che sono virus molto grandi che possono portarsi tutti gli enzimi necessari per la loro replicazione), mentre i virus a RNA replicano tutti nel citoplasma, ad eccezione dei virus influenzali e dei retrovirus.

 

(Si ringrazia Alex S. per la revisione)

 

Virologia

 

Replicazione e trascrizione virus a DNA                                                          Lezione 5 del 12.11.07

 

Virus a DNA.

Conoscere la differenza tra virus a DNA ed a RNA con le rispettive eccezioni è importante. Iniziamo quindi ad analizzare le varie strategie che adottano i virus a DNA per poter replicare e produrre i virioni di progenie.

Dopo la fase di adsorbimento e la fase di penetrazione, che avvengono singolarmente in maniera specifica con uno dei meccanismi visti la volta scorsa, tutti i virus a DNA replicano nel nucleo (eccezione i poxvirus). Il genoma di questi virus deve quindi penetrare anche nel nucleo. Nel nucleo questo genoma si esprime e trascrive degli RNA messaggeri, sintesi operata dalla RNA pol 2 della cellula. Questi RNA, una volta sintetizzati nel nucleo, vanno nel citoplasma dove si legano ai ribosomi (cosa che implica la presenza di un cap e di una coda di poly A terminale). Le informazioni contenute negli mRNA serviranno quindi per la sintesi delle proteine virali che vengono sintetizzate a livello del citoplasma; se il virus è però a replicazione nucleare, le proteine sintetizzate nel citoplasma migreranno nuovamente nel nucleo. Fra le varie proteine che vengono sintetizzate abbiamo generalmente proteine che servono per la replicazione del genoma del virus, come la DNA polimerasi che serve per la replicazione del proprio genoma. Tra le varie proteine abbiamo anche le proteine strutturali che, migrando nel nucleo, si assemblano per riformare la struttura del virus che verrà riempita dai genomi che si sono intanto replicati; in questo modo si formano i virioni di progenie.

Bisogna fare la differenza tra un virus a DNA nudo ed un virus con involucro. Un virus nudo viene rilasciato per lisi, mentre in un virus con involucro, i nucleocapsidi possono o venire rilasciati dal nucleo attraverso vescicole (che costituiranno l'involucro) o essere rilasciati a livello della membrana citoplasmatica, dove acquisteranno da essa l'involucro. I virus a DNA, nella loro replicazione nucleare, hanno dei vantaggi, in quanto possono usare molti degli enzimi cellulari e nucleari per la trascrizione, come la RNA pol 2, che serve per la sintesi degli mRNA, come proteine attivatorie e coattivatorie (fattori trascrizionali che facilitano la trascrizione) ed enzimi per la sintesi del cap e per la coda di poly A. I virus possono inoltre usare anche i meccanismi dello splicing (anche se solo alcuni virus lo subiscono). I virus possono usare anche enzimi cellulari per la replicazione del proprio genoma, coma la DNA pol e le altre proteine accessorie necessarie per replicare una molecolare di DNA (girasi, ATPasi, elicasi, primasi, RNasi, enzimi di riparo, ligasi).

 

Penetrazione nel nucleo dei virus a DNA.

La penetrazione nel nucleo avviene attraverso meccanismi di fusione o endocitosi. Un problema per questi virus a DNA è proprio la penetrazione nel nucleo. I virus possono avere un capside o un nucleocapside. Il capside è la struttura di un virus senza involucro mentre il nucleocapside è la struttura interna di un virus che possiede anche un involucro. Questi capsidi o nucleocapsidi possono raggiungere la membrana nucleare solo se hanno presenti nelle loro strutture sequenze NLS (sequenze di localizzazione nucleare). Quando però i virus arrivano nel poro nucleare, di 20-26 nm di diametro, non possono entrare direttamente, ad eccezione dei parvovirus.

I parvovirus sono virus a DNA ss molto piccoli con capside icosaedrico di diametro di circa 18-26nm. Essi penetrano nella cellula mediante endocitosi pH dipendente. Il loro capside è formato dalle proteine VP1, VP2 e VP3. La VP1 contiene una sequenza NLS che permette a questi virus, essendo molto piccoli, di essere gli unici in grado di penetrare direttamente nel poro nucleare. La sequenza NLS si lega infatti ai recettori dei pori nucleari (carioferine o importine) che permettono l’entrata diretta del virus nel nucleo, dove avviene la spoliazione.

In altri virus più grandi, come negli adenovirus, si ha il legame del capside a livello del poro. Qui il capside subisce un uncoating, che determina il rilascio del DNA che penetra nel nucleo: il DNA viene quindi iniettato nel nucleoplasma. Affinché un virus possa raggiungere la membrana nucleare ha però bisogno di alcune “autostrade”. Il citoplasma è una sostanza molto viscosa che non permette facilmente il movimento, le distanze dal nucleo possono essere inoltre anche grandi. Le “autostrade” sono formate dai microtubuli della cellula ospite. Nei microtubuli abbiamo le dineine che interagiscono con le proteine delle strutture capsidiche trasportandole verso il nucleo. L'adenovirus entra per endocitosi, nel vacuolo endocitotico viene lisato ed il nucleocapside si lega alla dineina per essere trasportato. Per gli adenovirus si è visto inoltre che il DNA, per complessarsi, si lega agli istoni cellulari.

L'herpes virus, che ha un involucro, possiede un meccanismo di fusione diretta; una volta che il nucleocapside è entrato, esso si lega alla dineina. Il virus arriva ai pori nucleari grazie alle sue NLS e, quando si è legato, subisce un uncoating finale e inietta il suo DNA nel nucleoplasma. Una cellula per dare un'infezione produttiva deve essere infettata da molti virus.

Per la penetrazione nel nucleo del virus influenzale (virus a RNA ma che si replica nel nucleo) vedi lezione precedente, paragrafo spoliazione.

 

Replicazione dei virus a DNA.

I virus a DNA possono avere un DNA lineare a singolo filamento o a doppio filamento. Il DNA a ss lo hanno solo i parvovirus mentre il DNA a doppio filamento lineare lo hanno i poxvirus, gli adenovirus e gli herpes virus. DNA circolare a doppio filamento lo hanno i poliomavirus e i papillomavirus (famiglia papovavirus) e gli hepadnavirus (virus dell'epatite B che hanno replicazione sia nucleare che citoplasmatica). Questi virus hanno tutti una replicazione nucleare. L'eccezione è quella dei poxvirus che hanno una replicazione citoplasmatica.

La replicazione del DNA è una replicazione semiconservativa con vari intermedi. Gli adenovirus, insieme agli herpes virus e ai poxvirus, codificano per la propria DNA pol virale che replica più velocemente ma con più errori. Queste DNA pol virali, essendo diverse da quelle eucariotiche, possono quindi essere target per molecole antivirali. Gli altri virus a DNA (parvovirus, papillomavirus e poliomavirus) usano invece la DNA pol cellulare.

Se la replicazione nucleare può essere un vantaggio perché fornisce vari enzimi per la trascrizione e replicazione, può essere anche un problema. Un primer, anche se iniziasse dal primo nucleotide, farebbe partire la replicazione del DNA dal 4o nucleotide, cosa che porterebbe alla perdita di DNA alle estremità, problema risolto in diversi modi che vedremo. La replicazione del DNA inizia sempre da regione dette ori. Queste regioni sono caratterizzate da siti di riconoscimento per proteine specifiche che sono proteine fondamentali che servono per aprire una bolla di replicazione; queste sequenze palindrome sono caratterizzate inoltre da avere molte basi AT, che facilitano lo srotolamento del DNA. Vicino alle sequenze ori esistono sequenze di legame per i fattori trascrizionali che servono per aumentare l'efficienza della trascrizione e della replicazione. Le proteine di riconoscimento dell'ori sono proteine che legano ori e che tendono a storcere questa regione aiutate anche da proteine cellulari. Molte delle proteine reclutate sulla regione ORI hanno infatti attività di elicasi ATP-dipendente, necessaria per lo srotolamento del DNA virale.

 

Trascrizione dei virus a DNA.

La trascrizione normalmente è fatta dalla RNA pol 2 della cellula e, per vari virus, esistono certe proteine che facilitano la trascrizione, proteine virali che spesso interagiscono con proteine cellulari per formare dei complessi che promuovono la trascrizione dei genomi virali. I virus hanno sempre la necessità di economizzare l'informazione genetica, quindi i genomi dei virus si dicono compatti, nel senso che sono in grado di sintetizzare mRNA su entrambe le eliche di DNA, presupponendo che la trascrizione vada in sensi opposti, come nel caso di un poliomavirus, SV40. Si usano quindi entrambe le eliche e spesso utilizzano anche un altro meccanismo, l'avere degli ORF diversi nello stesso gene che permettono di sintetizzare più proteine diverse. Altro meccanismo poco usato è quello dello splicing alternativo, per formare proteine leggermene diverse, meccanismo usato dagli adenovirus e da qualche proteina degli herpes virus. Normalmente tutti gli RNA dei virus hanno cap e coda di poly A formati dagli enzimi cellulari. La trascrizione avviene sempre nel nucleo eccetto per il poxvirus. Il poxvirus è un virus molto grande con un DNA molto lungo; esso può quindi permettersi di codificare enzimi propri. La prima trascrizione avviene all'interno della struttura virionica, in cui sono presenti già all'interno gli enzimi che effettuano la trascrizione. I geni sono senza introni e quindi non vi è splicing. Dopo la trascrizione avremo una proteina che causa il disassemblamento del capside, rilasciando il DNA all'esterno.

 

Una caratteristica della trascrizione dei virus a DNA è che la trascrizione ha un'organizzazione temporale. Un virus a DNA fa delle proteine che possono essere un numero limitato ma anche rilevante. Questo DNA deve quindi essere regolato nella sua trascrizione. I primi trascritti di solito sono proteine enzimatiche dette precoci, sono proteine che svolgono alcuni processi come la replicazione del genoma del virus, quindi proteine non strutturali. La loro sintesi permette la replicazione del DNA del genoma del virus e, solo dopo, abbiamo la trascrizione dei geni tardivi. La trascrizione dei geni precoci usa come stampo il DNA del virus penetrato, quindi vi saranno poche copie di trascritti; una volta che però si è avuta la replicazione del DNA virale, avremo una maggiore e più rilevante trascrizione di geni tardivi, che porteranno alla formazione delle proteine strutturali. In questo modo i virioni verranno riempiti dal genoma. Questa è detta trascrizione in due tempi. Nei virus herpetici abbiamo invece un'organizzazione temporale in tre tempi. In questo caso abbiamo i geni precoci che si distinguono in immediati precoci e nei precoci ritardati. Questa conoscenza si è ottenuta tramite trattamento con cicloeximide, molecola che blocca la sintesi proteica in quanto scarica i ribosomi da tutti gli mRNA. La trascrizione non è quindi toccata da questa molecola, cosa che implica che per i geni immediati precoci non c'è bisogno di altre proteine per effettuare la trascrizione. Gli RNA precoci ritardati sono invece cicloeximide sensibili, ovvero necessitano della sintesi di qualche proteina per essere espressi. Nell'herpes virus abbiamo cinque immediati precoci; due di questi servono per la trascrizione dei geni precoci ritardati. Anche i geni precoci servono per la sintesi delle proteine responsabili per la sintesi del DNA che poi danno luogo ai geni tardivi che possono essere divisi in due categorie γ 1 e γ 2. I gamma 1 vengono trascritti anche in assenza di DNA virale, mentre i γ 2 vengono trascritti solo dopo la replicazione del DNA virale. La trascrizione usa la RNA pol 2 della cellula. (successivamente la trascrizione degli herpes virus verrà vista più nel dettaglio)

 

Polyomaviridae.

Sono virus nudi a doppio filamento di DNA circolare. Alcuni virus che appartengono a questa famiglia sono JC e BK, che sono legati a patologie come la leucoencefalopatia multifocale progressiva e malattie renali. Il virus prototipo di questa famiglia è SV40 che è un virus a DNA che cresce normalmente nelle cellule di scimmia, di cui è endogeno. Si è visto che questo virus può avere una alto potere trasformante e quindi può essere oncogenico per cellule di topo embrionali o cellule di topi neonati (quindi non tanto per la scimmia). Questi virus sono nudi con capside icosaedrico (di circa 45nm) costituito dalle proteine VP1, VP2 e VP3. Il DNA è circolare e di piccole dimensioni circa 5,2kb. La caratteristica di questo DNA è che si complessa con varie proteine istoniche (H2A, H2B, H3 e H4) per formare nucleosomi. Il DNA, una volta arrivato nel nucleo, compie la sua trascrizione in due tempi. La trascrizione dei geni precoci e tardivi avviene sulle due molecole opposte della molecola circolare di DNA a partire da due promotori differenti, uno per i geni precoci e l'altro per la sintesi delle proteine strutturali. Il virus prima trascrive gli RNA precoci e poi, dopo che avviene la replicazione del DNA a partire dalla regione ori, sulle molecole di DNA iniziali parte la trascrizione dei geni tardivi (strutturali). Abbiamo anche lo splicing ma solo per un gene virale.

Analizziamo le funzioni di queste proteine. Le proteine strutturali servono per fare la struttura del virus. Le proteine precoci sono fondamentalmente due: la proteina T e la proteina t. Una deriva da un trascritto più grande, T appunto, mentre l'altra da un trascritto più piccolo, t. Queste proteine hanno funzione regolatoria, in quanto devono regolare la replicazione del virus. Le proteine dell'SV40 sono inoltre multifunzionali. Esse regolano la transizione della trascrizione da precoce a tardiva. La proteina T, sintetizzata nel citoplasma, deve tornare nel nucleo legandosi al DNA così da interrompere la sua stessa trascrizione, ma allo stesso tempo deve legarsi nelle regioni dei promotori dei geni tardivi per attivarne la trascrizione. La proteina t invece facilita la replicazione del DNA, srotolando il DNA a livello della regione ori per aprire una bolla di replicazione.

La replicazione del DNA di questo virus è bidirezionale (replicazione a θ). Due esameri di proteina T legano un sito (sito II) della ORI. La proteina T (elicasi) insieme alla RpA cellulare (proteina di legame ssDNA) srotolano il DNA in modo da creare la bolla di replicazione necessaria per la sintesi bidirezionale del DNA. Si forma quindi la bolla di replicazione dove si lega una proteina di binding del DNA cellulare; a questo punto può partire la DNA pol cellulare che replica. Quando la replicazione sta per iniziare, alla bolla si lega la DNA pol α con attività primasica; la primasi sintetizza dei corti primer che iniziano la sintesi di DNA; inizia la sintesi dell'elica leading mentre la lagging inizia dopo la formazione del complesso di replicazione. L'azione della topoisomerasi serve per rimuovere tutti i superavvolgimenti. La sintesi del DNA termina a 180 gradi da ori dove si congiungono le forche di replicazione.

Una ulteriore funzione che svolgono è quella di modificare l'ambiente cellulare. I virus a DNA devono infatti avere quasi tutti dei meccanismi per spingere la cellula verso la fase S, unica fase in cui il nucleo è in grado di sintetizzare DNA. Questo meccanismo è svolto attraverso l'interazione della proteina pRB (retinoblastoma) che controlla un fattore di trascrizione cellulare, E2F, che controlla i geni che fanno entrare la cellula in fase S. Nelle cellule di topo si capisce quindi perché questo virus è oncogenico in quanto le cellule murine hanno pochi meccanismi di controllo del ciclo cellulare. Queste proteine possono interagire anche con p53, un fattore trascrizionale che viene attivato in seguito a danno della cellula e che è coinvolto nel processo apoptotico. Una cellula infettata da un virus a DNA si accorge infatti che qualcosa va male, e p53 verrebbe attivato, portando a morte. I virus a DNA però sono in grado di interagire con esso inattivandolo o addirittura distruggendolo così da evitare l'apoptosi. La cellula diventa quindi un buon ambiente per la replicazione del virus e non muore. Le proteine tardive VP1, VP2 e VP3 servono solo a ricostruire il capside virale icosaedrico.

 

Papillomavirus.

Virus simile a quelli visti precedentemente, esso è rilevante per la patologia umana in quanto è causa di un alto rischio di tumore all'utero per le donne. Ne esistono più di 100 tipi. I meccanismi oncogenetici di questo virus sono simili a quelli di SV40. Il target delle proteine precoci è sempre la proteina del retinoblastoma ed il p53. Il capside di questo virus è icosaedrico nudo e il genoma è un DNA ds circolare di 8kb legato a istoni cellulari. A differenza di SV40, la trascrizione dei geni precoci e tardivi avviene sulla stessa elica di DNA. Ci sono vari geni: 7 geni E (precoci) e 2 geni L, L1 e L2, che sono i geni tardivi strutturali che costituiscono il capside. Il genoma di questo virus si integra nel DNA della cellula ospite e quindi la trascrizione, invece di essere legata all'infezione, avviene a partire dal genoma cellulare. Questi virus penetrano attraverso abrasioni dell'epidermide; il virus infetta per prime le cellule basali più profonde dell'epitelio. In queste cellule non differenziate si esprimono solo i geni precoci; poi, quando le cellule differenziano e si ha la replicazione del DNA cellulare, che include anche quello virale, vengono prodotte anche le proteine tardive. Questi virus sono legati anche a manifestazioni dermiche, come escrescenze della pelle cheratinizzate. Altra patologia sono i bomboloni che sono escrescenze non cheratinizzate che colpiscono le mucose. Altra patologia ancora è il carcinoma, tumore dovuto all'inserimento del genoma del virus all'interno del DNA.

C'è una costante sintesi di proteine precoci che sono l'E6 e L'E7 (oncogeni virali). La E6 si lega a p53 dando un segnale per l'ubiquitinizzazione e quindi di degradazione, così da impedire la sua funzione proapoptotica, mentre E7 si lega pRB che attiva il fattore di trascrizione E2F.

 

Adenovirus.

Sono virus nudi con capside icosaedrico caratterizzato da estroflessioni, come antenne, date dalla proteina 3 (la VAP del virus). Di questi virus ne sono stati identificati circa 100 sierotipi diversi che danno patologie lievi che interessano il tratto respiratorio o il tratto gastroenterico. Solo alcuni tipi possono dare congiuntivite. Questi sono virus che, una volta penetrati, difficilmente sono eliminati completamente. In maniera occasionale possiamo ricorrere nella stessa patologia da parte di un'infezione dall'esterno. Questo virus risiede nelle cellule del tessuto linfatico come monociti e macrofagi. Una grossa concentrazione di virus è presente a livello delle adenoidi e, se esso porta ad una grossa infiammazione delle adenoidi (esempio a causa di una sovrainfezione batterica), queste devono essere asportate. Anche le placche del Peyer del tratto gastrointestinale possono essere infettate come pure le tonsille.

Anche questi virus codificano per proteine che possono avere potere oncogenico su cellule di roditori. Le proteine che vengono regolate da questi virus sono sempre la pRB e p53. Il genoma è una doppia elica di DNA lineare lungo circa 35kb e caratterizzato dalla presenza di sequenze terminali invertite e ripetute all'estremità della molecola di DNA. Entrambe le estremità sono complessate covalentemente da una proteina terminale (PT) che funge da primer per la replicazione del DNA. Anche qui abbiamo trascritti precoci e ritardati. Le proteine precoci vengono fatte in parti diverse del genoma e prendono sempre il nome di E. Esse codificano per molte proteine che regolano l'ambiente cellulare e la replicazione del virus attraverso la sintesi della DNA pol e la proteina terminale nella forma di pre-proteina. Successivamente, a partire da un unico promotore, questi virus codificano, attraverso splicing, vari trascritti che sono le proteine tardive che servono per formare il capside: L1, 2, 3, 4 e 5. Tra le proteine precoci ricordiamo la E1a e la E1b che sono quelle che hanno un effetto transattivante e che interagiscono con pRB e p53.

Gli adenovirus, insieme agli herpes virus, codificano per la propria DNA pol virale che replica più velocemente ma con più errori. Una particolare strategia di replicazione viene usata dagli adenovirus che hanno una proteina terminale (che funge da primer per la replicazione) legata al 5' di ogni filamento. La proteina preterminale, formata da tre proteine, viene legata con un legame fosfodiesterico catalizzato dalla polimerasi virale ad una citidina presenta su una molecola di DNA. Questa proteina terminale interagisce con la pol virale che funge da primer per la sintesi della molecola di DNA. Il 3’OH di dCMP (citidina) serve da innesco per la sintesi (in continuo) del filamento di DNA complementare. Mentre procede la sintesi di questo DNA, l'elica complementare viene dislocata e viene legata da una proteina di legame sul singolo filamento di DNA. Un'elica viene allontanata e questa, sfruttando le sequenze ripetute terminali, può associarsi e formare una struttura a manico di padella dove troviamo una condizione simile a quella iniziale, dove si può legare una DNA pol e iniziare la sintesi dell'elica complementare. Alla fine del processo abbiamo due molecole di DNA; una proteasi virale cleava la proteina terminale e la rende matura fino ad arrivare al genoma del virus di partenza replicato.

 

Herpesviridae.

Questi virus hanno un nucleocapside icosaedrico (di circa 150nm) racchiuso da un involucro. Il genoma è formato da una molecola di DNA a doppio filamento lungo 150kb. Sono stati identificati circa 100 virus herpetici che sono stati distinti nella sottofamiglia α, β  e γ, differenti sulla base delle proprietà biologiche. Gli α hanno un ciclo di replicazione molto rapido di 24 ore, hanno un ampio tropismo, ed infettano il sistema nervoso. I β herpesviridae hanno un ciclo più lento di vari giorni, hanno uno spettro d'ospite limitato (solo alcune cellule) e possono infettare anche cellule linfatiche. I γ hanno un ciclo ancora più lungo, qualche settimana, hanno uno spettro d'ospite molto limitato, ovvero solo linfociti B o T. Tra gli α abbiamo i generi simplex virus (herpes simplex di tipo 1 o 2) e varicellovirus. Tra i β abbiamo il genere citomegalovirus ed il genere roseolovirus (formato da herpes simplex di tipo 6 e 7). Tra i γ abbiamo il virus Epstain Barr ed il genere Rhadinovirus (come l'herpesvirus 8).

Analizziamo più nel dettaglio un herpes simplex di tipo 1 (HSV 1). Esso ha un DNA a doppio filamento lineare di 150kb che ha un'organizzazione particolare con due sequenze uniche Ul e Us, entrambe fiancheggianti con sequenze interne ripetute e terminali molto simili (Rl, Rs, Rt e Ri). Questa molecola lineare, una volta che è penetrata nel nucleo, circolarizza grazie alla presenza delle due sequenze terminali ripetute. Inizia quindi la trascrizione abbastanza complicata con circa 84 proteine differenti. La trascrizione è organizzata in tre tempi. I primi trascritti sono quelli dei geni α immediati precoci. Esistono 5 di questi trascritti e quindi abbiamo 5 proteine ICP0, ICP4, ICP27 ecc; ICP0 e ICP4 sono proteine transattivanti che inducono la trascrizione dei geni a valle precoci β, ovvero ICP27, 22 e 47, che facilitano la trascrizione del virus. La ICP47 facilita l'esporto degli RNA virali. La ICP22, insieme al DNA, viene trasportata nel nucleo. Essa è una proteina del tegumento del virus che serve per degradare gli RNA cellulari e virali. Questo però comporta una degradazione maggiore degli mRNA cellulari dato che quelli virali vengono sempre trascritti.

Una volta che queste proteine sono state sintetizzate nel citoplasma, esse devono andare nel nucleo per regolare la trascrizione del virus. I geni EBTA (?) sono deputati alla sintesi del DNA. Abbiamo geni fondamentali come la DNA pol del virus ed altre proteine che servono ad aprire la bolla di replicazione della molecola circolare; altri geni β sono invece enzimi per la sintesi di nucleotidi o proteine che spingono la cellula ad andare in fase S. La replicazione del DNA è a circolo rotante, un processo complicato. La replicazione serve per fare avvenire la trascrizione dei geni γ, trascrizione regolata dalle proteine transattivanti ICP0 e ICP4. I geni γ tardivi verranno quindi trascritti solo dopo la replicazione del virus.

Il genoma dell'herpes simplex di tipo 1 ha 3 ori, due all'altezza delle regioni Vs ed una all'altezza della V1. Si è visto sperimentalmente che, se leviamo due delle tre ori, questa può permettere la replicazione del DNA. La replicazione è a circolo rotante: si ha un taglio al 3' OH di uno dei filamenti che viene usato come primer. Nel nucleo della cellula il genoma del virus si trova legato in concatenameri legati testa coda; successivamente, da questi, si formeranno i genomi virali a seguito del processo di incapsidamento.

 

 

 

Parvovirus.

Essi sono piccoli virus a DNA a singolo filamento (4,5-6kb) con capside icosaedrico nudo (18-28nm), che quindi facilmente entrano nel poro nucleare. I parvovirus sono virus che hanno ben poca informazione genetica e spesso dipendono dalla presenza di un altro virus. Sono infatti virus difettivi e satelliti di altri virus come nel caso degli adeno-associati che si presentano sempre in associazione con gli adenovirus. Essi, non avendo infatti enzimi necessari per la replicazione, hanno bisogno di virus helper che facilitino la loro replicazione e trascrizione. La molecola lineare di DNA a singolo filamento è caratterizzata da avere estremità abbastanza lunghe di sequenze palindromiche (115nt) che permettono a questa molecola di assumere una forma ripiegata fondamentale affinché questa venga trasformata in molecola a doppio filamento. Questo DNA può essere trascritto in proteine precoci e tardive. Le proteine precoci non strutturali (gene NS1 e rep) vengono espresse sia usando splicing alternativi che ORF differenti mentre le proteine che formano il capside virale (generalmente 2-3, geni cap) vengono espresse solo a partire da ORF differenti.

I parvovirus hanno sequenze terminali ripetute che gli fanno assumere una forma ad hairpin. La loro replicazione segue infatti il rolling hairpin model. Appena il DNA entra, una molecola complementare di DNA viene sintetizzata ad opera della DNA pol cellulare usando come primer l'hairpin che si forma. Una proteina codificata dal virus, rep78, cleava e taglia al terminale (hairpin) permettendo la sintesi di tutta la molecola di DNA da cui si separano i genomi figli.


Poxvirus.

I membri della famiglia dei poxviridae sono i virus del vaiolo che sono grandi virus di circa 300nm con all'interno un DNA ds lineare di circa 200kb. Dal punto di vista strutturale essi hanno una struttura unica caratterizzata da una forma a mattone che possiede sulla superficie varie strutture fibrillose di natura proteica. Anche questi virus sono parecchi e, quindi, abbiamo vari generi come gli orthopoxvirus a cui appartiene il virus del vaiolo umano. Questo virus è stato per fortuna debellato tramite vaccini. Ci si accorse che la stessa patologia umana, l'avevano i bovini in maniera simile, seppure non ne causava la morte. Il medico Jenner prese da una mucca infetta dei tessuti e ne iniettò i liquidi in un bambino (credo il figlio) che venne “vaccinato”. Il termine vaccinazione deriva proprio da questa storia.

Questo virus è molto stabile e resiste fino a mesi alla temperatura di 4 gradi, a differenza degli altri virus. La caratteristica del genoma di questo virus è che il suo DNA è legato alle estremità covalentemente, tramite legami fosfodiesterici all'estremità di sequenze terminali ripetute invertite, quindi un DNA lineare a doppio filamento con le estremità coese. All'esterno è presente un involucro lipidico con strutture fibrillari; all'interno abbiamo invece una struttura proteica detta core dove risiede anche il DNA; il tutto è fiancheggiato da corpi laterali di natura proteica. Il DNA si trova associato a proteine basiche “iston like” e nel core sono presenti già degli enzimi come la RNA pol, la poliadenilato pol, la metil-transferasi e la guanilil-transferasi. La trascrizione è in due tempi e i trascritti non hanno introni ne subiscono splicing. Questo virus ha replicazione citoplasmatica (seppure a DNA) e quindi non entra nel nucleo a seguito del disassemblamento. Parte della trascrizione dei geni precoci avviene anche grazie agli enzimi precoci presenti già nel core. Questi RNA escono dalla struttura virionica e formano delle proteine. Alcuni di questi RNA precoci servono per fare l'uncoating del virus, la replicazione del DNA e la sintesi delle proteine strutturali.

Nella prossima lezione vedremo l'ultima famiglia di virus a DNA da analizzare, gli hepadnaviridae.

 

(Si ringrazia Alex S. per la revisione)

 

Virologia

 

Hepadnavirus e virus a RNA p1                                                                       Lezione 6 del 15.11.07

 

Hepadnavirus.

Per concludere con i virus a DNA parliamo della famiglia degli hepadnaviridae (virus dell'epatite B). Rispetto agli altri virus che abbiamo visto che hanno una trascrizione in due tempi o tre tempi, questo virus a DNA ha una strategia replicativa diversa. Nei soggetti infettati da questo virus troviamo una grossa concentrazione di particelle virali di forma sferica di circa 40nm che vengono dette particelle di Dane (virus infettante completo); possiamo trovare pure delle particelle subvirali che possono avere una forma filamentosa o circolare con un diametro di circa un terzo della particella virale completa: per questo si definisce virus pleiomorfo (virus con tante forme differenti). La vera particella virale infettiva è formata da un involucro lipidico in cui è inserita la proteina dell'involucro che viene chiamata antigene Australia (perché molti affetti erano stati trovati in Australia) o HbsAg. All'interno troviamo un capside icosaedrico che contiene una molecola genomica del virus costituita da DNA circolare a doppio filamento incompleto. Le altre particelle subvirali sono invece formate solo dall'involucro e dall'antigene Australia, questo perché si forma una gran quantità di questo antigene che poi forma in gran parte queste particelle subvirali. Mentre la struttura virionica è infettante, le particelle subvirali non sono infettanti perché non portano informazione genetica.

Queste particelle costituiscono anche uno dei meccanismi con cui il virus riesce ad instaurare un'infezione persistente. L'epatite B è una malattia infettiva che causa epatite, ovvero infiammazione del fegato con distruzione degli epatociti. Circa il 30-40% di persone infettate instaura una così detta infezione cronica in cui l'organismo non riesce ad eliminare il virus, che continua a risiedere e replicare nel fegato causando danni epatici rilevanti che possono portare anche a cirrosi o epatocarcinoma. L'infezione cronica è data dal fatto che queste particelle subvirali hanno l'antigene sulla loro superficie e vanno quindi ad inibire la risposta umorale, dato che gli anticorpi si legano a questa particelle senza però uccidere il vero virus. Bisogna sottolineare che le particelle subvirali non sono stati di maturazione del virus ma vere particelle originate come tali. Esse quindi sottraggono anticorpi e questo implica anche che sulla superficie dell'epatocita ci sia una grande quantità di glicoproteina che viene riconosciuta dagli anticorpi, che causano la morte dell'epatocita per citolisi: è quindi la risposta dell'ospite che distrugge gli epatociti in quanto il virus non è litico.

Le particelle di Dane sono infettanti sia perché hanno il capside con il genoma, sia perché hanno nelle loro particelle di Dane tre tipi diversi di questa glicoproteina che si forma a partire da un'unica sequenza genica ma per ORF diversi. Abbiamo una proteina large che comprende tutto il trascritto, una proteina middle dove manca una sequenza ed una proteina major che è prodotta in maggiore quantità (tutti usano comunque lo stesso mRNA). Le porzioni comuni di queste proteine sono identiche. La major viene prodotta di più e la maggior parte di questa proteina è quella che forma le strutture incomplete subvirali. L'unica proteina che costituisce la VAP del virus è la proteina large, che interagisce con i recettori dell'epatocita. Solo però la particella di Dane è quella infettante e completa.

Il DNA è a doppio filamento circolare incompleto ed abbiamo un filamento di DNA negativo lungo 3200bp mentre il complementare è circa il 50-80% dell'altro filamento (è quello incompleto). Il genoma sintetizza poche proteine ed usa diversi ORF. Abbiamo quindi un gene S poi un gene P, un gene C ed uno X. Il gene P è il gene che codifica per la polimerasi virale; il gene C è quello che codifica per la proteina capsidica; il gene X è quello per una proteina transattivante che facilita la trascrizione del virus. Le tre proteine “Australia” dell'involucro sono prodotte a partire dal gene S. All'interno del capside troviamo la DNA pol che è covalentemente legata all'estremità 5' del filamento di DNA negativo (quello completo). Il virus penetra probabilmente con un meccanismo di fusione (non si sa bene se a livello della MP o dentro un endosoma). Il nucleocapside entra nel citoplasma. Il processo di penetrazione attiva la DNA pol del virus che si trova covalentemente legata al filamento completo all'interno del capside parzialmente disassemblato. Essa completa il filamento dell'elica positiva del DNA. Il genoma del virus diventa quindi completo e circolare e viene trasportato all'interno del nucleo della cellula. Qualsiasi molecola di DNA circolare è portata nel nucleo dove subisce un superavvolgimento e inizia ad essere trascritta da parte di una RNA pol 2 della cellula ospite. Si formano due tipi di trascritti, dei trascritti più corti che sono mRNA che servono per la sintesi delle proteine del virus. Poi si forma anche un trascritto di 3500 basi (quindi più lungo del genoma) che viene chiamato pre-genoma. Questo mRNA viene trasportato nel citoplasma dove incontra le proteine sintetizzate dagli mRNA come la proteina C che comincia a formare la struttura capsidica incorporando anche l'mRNA genomico insieme alla DNA pol così da riformare la struttura iniziale.

La DNA pol virale è in grado di esprimere anche un'attività di trascrittasi inversa. All'interno di questa particella subvirale, il precapside, la DNA pol retrotrascrive la molecola di RNA formando l'elica complementare negativa completa di DNA. Le sequenze in più vengono perse durante la retrotrascrizione che riforma il filamento di 3200 basi. La DNA pol all'interno di questo precapside copia l'elica complementare del DNA, l'elica positiva. Nel frattempo il virus matura ed arriva sulla membrana. Si ha l'assemblaggio definitivo del capside e la gemmazione del virus. Questo processo di maturazione fa si che la DNA pol non possa completare la sintesi del DNA complementare in quanto, quando il capside si è formato in maniera definitiva, il virus gemma e non ha più nucleotidi per completare il filamento. Se la maturazione ritarda e la DNA pol riesce a completare la copia dell'elica negativa formando un DNA circolare, il nucleocapside si disassembla ed il DNA circolare esce ritornando nel nucleo così da reiniziare il ciclo. La DNA pol viene quindi inibita dall'assemblamento del capside. L'attività della trascrittasi inversa fa si che dopo che questo RNA è stato usato come stampo per retrotrascrivere DNA, la DNA pol, con la sua attività di Rnasi, degrada l'mRNA. Quindi questo è un virus a DNA che ha come intermedio un mRNA.

Spesso, insieme all'infezione cronica dell'apatite B, si osserva la coinfezione di epatite δ (delta), un virus a RNA. Questo virus è un virus satellite con RNA a singolo filamento e pochissime basi che sintetizzano solo la proteina del capside detto antigene δ. Tutto quello che serve per la replicazione di questo RNA viene fornito dalle funzioni presenti grazie al virus dell'epatite B, compreso i fosfolipidi e l'antigene Australia. Questo virus può quindi replicarsi solo in cellule coinfettatte dal virus dell'epatite B. In presenza di questo virus satellite, l'epatite B replica inoltre più velocemente dando un esito più grave.

 

 

 

Tipi di virus a RNA e caratteristiche generali.

Possiamo distinguerne diversi tipi:

  • Abbiamo i virus a polarità positiva che hanno un RNA con la stessa polarità degli mRNA. Un RNA che può subito legare i ribosomi ed essere tradotto tale e quale è. Essi codificano per una propria RNA pol RNA dipendente. Solo alcuni virus a RNA a polarità positiva sono provvisti di involucro (Sindbis).
  • Poi abbiamo virus a polarità negativa con genoma complementare all'mRNA e quindi non in grado di legarsi ai ribosomi. In questo caso necessita di sintetizzare degli mRNA per sintetizzare le sue proteine. I virus a RNA negativo devono avere una RNA pol RNA dipendente per trascrivere il loro genoma. Da un punto di vista morfologico i virus a RNA a polarità negativa hanno l'involucro (VSV, influenza ecc).
  • Poi abbiamo virus a doppio filamento formati da un filamento negativo appaiato ad uno positivo. Anche questi virus devono avere una trascrittasi (RNA pol RNA dipendente) in quanto essi replicano nel citoplasma dove non ci sono enzimi con questa attività. I virus a RNA ds (reovirus) hanno un capside doppio.

 

I virus a a RNA replicano nel citoplasma, eccetto il virus dell'influenza ed i retrovirus. Questo comporta degli svantaggi: tutti virus a RNA devono sempre e comunque codificare per una RNA pol RNA dipendente, cosa che comporta occupazione di spazio nel proprio genoma; questo perchè nella cellula non esiste questo enzima. Queste RNA pol RNA dipendenti non hanno però bisogno di primer e quindi non c'è il problema di trovare dei meccanismi per non perdersi i pezzi terminali del genoma, problemi che invece avevano i virus a DNA. Lo stesso enzima RNA pol può essere anche usato sia per la trascrizione che per la replicazione del genoma, quindi un solo enzima per due funzioni. Le RNA pol RNA dipendenti non hanno funzioni di editing quindi non possono correggere errori durante la sintesi, errori che si accumulano portando ad una evoluzione più rapida di questi virus. Queste RNA pol virali necessitano spesso, per la loro funzione, di proteine accessorie di origine cellulare o virale. Solo alcune hanno bisogno di primer come proteine legate al 5'; altre RNA pol usano invece come primer delle strutture cap al 5' degli mRNA. Esistono delle molecole e sostanze, come l'actinomicina D, che sono in grado di intercalarsi al DNA, bloccando la RNA pol cellulare ed anche alcune RNA pol DNA dipendenti di virus a DNA a doppio filamento, senza però bloccare l'azione dell'RNA pol RNA dipendente dei virus a RNA. Tramite questa caratteristica essa si distingue dalle altre RNA pol. Altri parametri caratteristici sono che è Rnasi sensibile e Dnasi resistente.

I virus a RNA penetrano o per fusione o per endocitosi ed il capside in entrambi i casi viene trasportato a siti di replicazione specifici. I siti di replicazione sono le membrane del reticolo endoplasmatico o del golgi e, per arrivare a questi siti, anche loro usano il sistema della dineina e dei microtubuli, come i virus a DNA. La trascrizione di questi virus è regolata da meccanismi molto specifici ma, nonostante tutto, i trascritti di questi RNA devono essere analoghi agli mRNA cellulari per esser letti e tradotti dai ribosomi: quindi devono essere RNA monocistronici con cap e coda di poly A.

 

Picornavirus (pol +).

E' una famiglia che presenta due generi, quelli degli enterovirus e quella dei rhinovirus. Entero sono quelli che infettano il tratto gastroenterico mentre i rhinovirus infettano le mucose del naso. All'interno di questi virus esistono virus differenziabili. Le differenze di proteine capsidiche sono rilevanti per enterovirus e rhinovirus. Un virus per infettare il tratto gastroenterico deve essere ingerito e passare nello stomaco che ha un pH acido che tende a disassemblare queste proteine. Tutti questi virus enterici devono quindi avere capsidi con proteine in grado di resistere a pH acido fino ad arrivare al tratto enterico. Il rhinovirus, invece, se lo ingerissimo morirebbe, mentre quando lo inaliamo ci infettiamo. Un'altra caratteristica biologica differenziativa è che mentre gli enterovirus replicano in laboratorio negli incubatori a 37 gradi, per un rhinovirus bisogna abbassare la temperatura del nostro incubatore a 35 gradi perché temperature maggiori distruggono il virus. La febbre è indotta da processi infiammatori ed è un meccanismo di difesa contro infezione batteriche e virali che non riescono più a replicarsi a certe temperature.

Di rhinovirus ne esistono circa 120 sierotipi (non hanno una struttura comune a tutti) ed è per questo che abbiamo sempre il raffreddore. Fra gli enterovirus ci sono vari virus come i poliovirus, i coxsackie virus A e B, gli echovirus, gli enterovirus come l'enterovirus 72 che causa epatite A. Tutti quanti hanno una struttura con capsidi nudi a simmetria icosaedrica di circa 30nm formati dalle proteine VP1, VP2, VP3 e VP4. All'interno dei capsidi abbiamo il genoma del virus con molecole di RNA a singolo filamento di polarità positiva. All'estremità 3' si trova una coda di poly A e all'estremità 5' è legata covalentemente una piccola proteina detta VPg mediante un legame fosfodiesterico di un residuo di tirosina.

Quando il virus contatta la cellula si ha il riconoscimento del recettore tramite la vap VP1 presente ai vertici dell'icosaedro. La VAP del rhinovirus contatta il recettore ICAM che è una molecola di adesione cellulare. Il contatto fa si che si abbia un disassemblamento parziale del capside; vp4 si stacca, il capside si allarga così da permettere la fuoriuscita dell'RNA genomico nel citoplasma. Nel citoplasma degli enzimi cellulari cleavano la VPg e questo RNA diventa di fatto un mRNA anche se non ha il cap; esso possiede però delle lunghe sequenze TR (terminali ripetute) che permettono il legame al ribosoma. Questa molecola a polarità positiva si lega al ribosoma ed inizia la traduzione di un'unica proteina di circa 240kD. Questa proteina viene cleavata dalla proteasi 2A (che è stata appena prodotta) dato che questa sequenza 2A ha un'attività autocatalitica che determina, durante la traduzione, il cleavaggio della proteina in due segmenti P1 e P2-P3. Quindi appena si arriva a 2A la proteina cleava se stessa e fa il primo frammento P1. Il frammento P1 viene a sua volta cleavato da un'altra proteasi che ugualmente si crea durante il processamento, la proteina 3C che cleava sia il frammento P1 che P2 e P3. Dal P1 di formano tre polipeptidi VP0, VP3 e VP1. VP0 durante la maturazione del capside viene ulteriormente cleavata per formare VP4 e VP2 (così da formare tutte e quattro le proteine capsidiche). Circa un terzo del genoma è deputato alla sintesi di proteine strutturali mentre due terzi sono proteine enzimatiche. Nel processo di cleavaggio si forma anche la replicasi (RNA pol RNA dipendente). Le proteine 3A e 3B sono importanti per il processo di replicazione, (3B forma la VPg). La parte distale dell'mRNA codifica quindi per proteine fondamentali per la replicazione del virus.

Parliamo di uno dei picornavirus più studiati, il poliovirus. Il polio si lega a recettori PVR(cd155) ed entra con meccanismo diretto con formazione del poro che può avvenire o sulla membrana o sulla vescicola endosomiale. La VPg viene cleavata nel citoplasma; si ha quindi la sintesi della poliproteina che successivamente viene cleavata. Le proteine strutturali incominciano ad assemblarsi formando i capsidi. Si formano dei precapsidi a partire da VP1, VP3 e VP0. Si forma anche la 3D che è la pol virale che va ad usare la molecola genomica per sintetizzare una copia complementare, detta antigenoma, con polarità opposta (-). Il primer viene fornito dalla VPg. L'antigenoma viene usato sempre dalla stessa pol virale per sintetizzare le copie del genoma virale con polarità +. Queste molecole sintetizzate vengono assemblate nel capside virale precostituito e l'entrata dell'RNA nel capside permette la trasformazione di VP0 in VP2 e VP4 che forma il capside descritto all'inizio, capside compatto e completo. Il virus quindi esce per lisi della cellula.

Le proteine 3AB sono fondamentali per l'aggancio alle membrane del reticolo ed infatti si inseriscono in esso. La 3B è anche la VPg. Il complesso 3AB si lega al reticolo endoplasmatico, arriva la proteasi che cleava il frammento ma solo dopo che questa proteina 3AB è stata riconosciuta dalla RNA pol, che come primo atto forma un legame fosfodiesterico tra un AA della proteina 3AB (tirosina) e la coda dell'mRNA che deve essere copiato. Inizia quindi a copiare l'RNA positivo formando l'RNA negativo (antigenoma). Con lo stesso meccanismo poi si formeranno i genomi positivi. La 3C cleava 3AB formando la VPg, che rimane legata al genoma. La VPg funge anche da primer per far avvenire la trascrizione.

I virus a RNA si regolano a seconda della quantità delle proteine presenti nel citoplasma della cellula. All'inizio abbiamo una quantità di proteine capsidiche basse, e di fatto l'RNA positivo che si forma sarà fondamentalmente deputato alla traduzione in quanto non ci saranno quantità sufficienti di capsidi. Quando i genomi dei virus aumentano, aumentano anche le proteine e si arriva ad una condizione in cui le proteine capsidiche sono elevate quindi i genomi verranno incapsidati. Con questo meccanismo si regola la replicazione. Il passaggio dalla fase 1 alla fase 2 è di circa 6 ore.

 

Togavirus (pol +).

Famiglia togaviridae con due generi, α virus e rubivirus. La particella è di 24 nm con capside icosaedrico (formato dalla proteina C) ed involucro (con peplomeri eterodimeri delle glicoproteine E1 e E2). Esso non ha uno strato di proteina di matrice ma le code intravirali delle glicoproteine dell'involucro prendono direttamente contatto con le proteine del capside. Il genoma è a RNA a singolo filamento di polarità positiva di circa 15kb, identico ad un mRNA messaggero con al 5' un cap e al 3' una coda di poly A. Il genoma è un mRNA messaggero completo che viene riconosciuto dal ribosoma ed inizia la traduzione, che coinvolge circa un terzo della molecola e che forma una poliproteina che viene cleavata da una proteasi, nsP2. Le altre proteine formano la RNA pol virale ed altre proteine accessorie che servono per il processo di trascrizione. Questa pol virale si lega al 5' e trascrive un RNA a filamento negativo. Da questo filamento sempre lo stesso enzima trascrive degli RNA subgenomici che servono per la sintesi, attraverso processamenti proteolitici, delle proteine strutturali. In questo modo il virus organizza più accuratamente la sua trascrizione in quanto prima sintetizza le sue proteine funzionali e poi le sue proteine strutturali; quindi prima la RNA pol fa un filamento negativo e poi lo ricopia facendo le proteine strutturali. Ricapitolando, la strategia che viene usata da questi virus per dividere le proteine virali da quelle strutturali è la seguente: in un primo momento l'RNA (+) viene tradotto solo parzialmente, a livello cioè della regione in 5' della molecola ribonucleotidica. Non a caso questa regione codifica per le subunità della polimerasi virale, che può quindi procedere alla replicazione dell'RNA (+) in molecole complementari di RNA (-). Tutta la molecola genomica di RNA (+) è sottoposta a questa duplicazione, per cui si formano molecole di RNA (-) che portano l'intera informazione genetica portata dallo stampo genomico infettante. Tutte le molecole RNA (-) così formate sono trascritte in RNA complementari e quindi a polarità positiva, ma non tutti sono trascritti nello stesso modo. Si formano molecole di RNA (+) di dimensioni ridotte (subgenomiche) nelle quali si porta l'informazione genetica relativa soltanto a quella parte di RNA che non è stata tradotta all'inizio (quindi tutta la molecola tranne l'estremità 5'). Da questo RNA (+) subgenomico si ottiene direttamente per sintesi ribosomiale una poliproteina, da cui si scindono varie proteine strutturali (capsidiche); ma si formano anche molecole di RNA (+) genomico, della stessa dimensione dell'RNA (-) stampo, che risultano quindi essere identiche al genoma virale e infatti sono utilizzate nell'assemblaggio dei virioni.

 

Coronavirus (pol+).

La famiglia dei coronaviridae appartiene all'ordine nidovirales. I coronavirus infettano varie specie animali, sia aviarie che mammiferi. Esistono due virus umani di questa famiglia (HCoV – human coronavirus). Qualche anno fa è emerso il virus della SARS che appartiene a questa famiglia. Esso è un coronavirus che infetta molti mammiferi. Esso ha avuto delle mutazioni, a causa della RNA pol non particolarmente efficiente, che hanno causato il salto di specie che ha permesso l'infezione anche nell'uomo, con mortalità del 40%. Il propagarsi del virus per fortuna è stato bloccato tramite isolamento dei soggetti infetti.

I corona hanno un involucro in cui sono inserite almeno due glicoproteine E1 ed E2. Entrambe sono transmembrana ed in altri casi possiamo avere anche un'altra proteina He (emoagglutinina esterasi). All'interno dell'involucro troviamo una proteina M di matrice che tiene legato il nucleocapside con l'involucro. Il nucleocapside presenta simmetria icosaedrica ed il genoma è a RNA a singolo filamento a polarità positiva. Questo RNA a polarità positiva ha una strategia abbastanza simile a quella dei togavirus. La penetrazione avviene probabilmente per fusione. L'RNA genomico presenta un 5' cap ed una coda di poly A al 3'. Esso viene tradotto nella prima parte che codifica per la polimerasi virale ed altre proteine precoci. La pol copia quindi la molecola di genoma in molecole negative; le molecole di genoma negative vengono usate dalla stessa pol per formare vari messaggeri che hanno sia il 3' che il 5' identico, in quanto la trascrizione di questi RNA avviene in sequenze specifiche ripetute che servono come attacco della polimerasi per la sintesi degli mRNA. Si formano varie proteine e l'antigenoma viene usato per la sintesi della molecola complementare che viene incapsidata e ricoperta dall'involucro che si acquisisce a livello delle membrana del reticolo endoplasmatico; infine questi virus vengono secreti per esocitosi.

 

 

Paramyxovirus (pol -).

Abbiamo due sottofamiglie: i paramyxovirus che comprendo i virus parainfluenzali umani, il virus della parotite, il virus sendai e il virus della malattia di New Castle; poi abbiamo i morbillovirus come quello umano e quello del cimurro del cane. Poi abbiamo il pneumovirus che comprende il virus respiratorio sinciziale umano e di altri animali.

Essi sono virus abbastanza circolari con involucro in cui sono inserite le glicoproteine HN ed F. Uno strato di matrice (formato dalla proteina M) sostiene l'involucro che permette l'ancoraggio al nucleocapside con simmetria elicoidale che contiene al suo interno RNA a singolo filamento a polarità negativa. Passiamo ad analizzare più nel dettaglio il virus parainfluenzale. Abbiamo un involucro con due glicoproteine, HN ed F. La F protein media la fusione sulla membrana mentre la HN è una proteina che possiede unite in una, le funzionalità della proteina HA (emoagglutinina) e della proteina NA (neuraminidasi) del virus influenzale. All'interno abbiamo il capside con la proteina N che racchiude la molecola genomica. Associato al capside elicoidale abbiamo il complesso della pol formato da due proteine, L e P.

L'adsorbimento avviene attraverso HN che riconosce l'acido sialico. La proteina F fonde con la membrana della cellula con meccanismo pH indipendente che poi libera il genoma del virus che viene trasportato nei siti di replicazione del reticolo.

In mezzo ai blocchi genici che costituiscono i geni della molecola di RNA troviamo delle sequenze particolari che vengono chiamate EIS (end intermediate start) che servono per effettuare una trascrizione polarizzata strettamente regolata. Le sequenze “end” sono le sequenze terminali (che quindi si trovano a valle del gene trascritto) che servono per formare la coda di poly A del trascritto che si forma. Abbiamo poi delle sequenze più lunghe “intermediate” che non vengono trascritte ed in cui la RNA pol si stacca. Successivamente, andando ancora a valle, troviamo la sequenza “start” in cui la RNA pol può riattaccarsi sintetizzando la sequenza del cap necessaria per la formazione del successivo RNA messaggero; quindi, in mezzo ad ogni blocco genico, abbiamo le sequenze end, intermediate e start. (Ricordate che il genoma ha polarità – quindi i trascritti che si formano avranno polarità +).

Questo meccanismo permette la formazione di mRNA monocistronici. L'iniziale attacco della RNA pol sul genoma del virus si ha attraverso il riconoscimento di una parte di sequenze al 3', dette leader, che sono separate dal gene N da una sequenza intergenica. La RNA pol come prima cosa sintetizza il complementare che forma l'mRNA leader che non codifica nulla ma serve solo a regolare la replicazione del genoma. Poi incontra la sequenza intergenica (intermediate), si stacca e si attacca alla sequenza successiva. Si forma quindi l'mRNA del gene N. Quando l'RNA pol si stacca può, o attaccarsi alla sequenza start successiva, o ricominciare dalla sequenza intergenica tra leader e proteina N, perché questa ha uno start più forte che richiama la pol di nuovo a se. Il succo del discorso è che dal nostro RNA genomico, tramite le sequenze EIS, si vengono a formare molti più RNA messaggeri per il gene N rispetto all'ultimo gene che è il gene L. L'ordine dei geni è infatti il seguente: N (nucleocapside) – P (fosfoproteina) – M (matrice) – F (fusione) – A (attacco) – L (RNA pol). L'ordine fisico dei geni (l'ordine dei geni nella molecola a polarità negativa!) rispecchia anche un ordine decrescente di trascrizione dovuto dalla trascrizione polarizzata spiegata prima.

I livelli di proteina N sono quelli che regolano la transizione tra trascrizione e replicazione. Se c'è poca proteina N che incapsida l'RNA, la molecola di RNA formerà gli RNA monocistronici che vengono tradotti in proteine. Quando abbiamo invece molta proteina N, questa silenzia la trascrizione andando a legarsi sulle sequenze EIS, che quindi non possono svolgere più la loro funzione di staccare la pol, così che la polimerasi stessa possa sintetizzare la molecola complementare intera per dare avvio alla replicazione del genoma virale.

Infine, nella fase di gemmazione, la proteina M altera la membrana della cellula ospite inducendo la fuoriuscita della gemma virale, che si porta dietro il genoma.


(Si ringrazia Alex S. per la revisione)

 

Virologia

 

Virus a RNA p2                                                                                                 Lezione 7 del 19.11.07

 

Rhabdoviridae (pol -).

Questi virus sono caratterizzati da avere una forma particolare a proiettile. Essi hanno un genoma costituito da una molecola lineare a singolo filamento di RNA con polarità negativa. Il capside è elicoidale e nell'envelope è inserita la glicoproteina G. A livello di famiglia abbiamo i generi lyssavirus (tra cui abbiamo il virus della rabbia che può infettare i mammiferi), ed i vesciculovirus (come il VSV che è il prototipo di questa famiglia e che può infettare oltre ai mammiferi anche insetti e piante, quindi ha uno spettro d'ospite molto ampio).

Tutti gli studi su questa famiglia sono stati fatti sul VSV (virus della stomatite vescicolare) che adesso vedremo meglio. Esso possiede un envelope, al di sotto del quale vi è la matrice; nell'envelope sono inseriti i peplomeri di glicoproteina G. All'interno abbiamo il genoma del virus organizzato in un capside elicoidale grazie al complessamento della proteina N (nucleoproteina). All'interno, essendo un virus a RNA negativo (come abbiamo visto anche per i paramyxovirus), deve portarsi il complesso della RNA pol (trascrittasi), formata da due proteine, la P e la L; il complesso nello specifico è formato da quattro proteine P ed una proteina L. Queste proteine sono codificate dal genoma del virus che presenta geni in sequenza, in cui ogni gene è separato dalle sequenze EIS, al fine di codificare per mRNA monocistronici (come abbiamo anche visto con i paramyxovirus). Il ciclo di replicazione di questo virus inizia sempre dall'adsorbimento della glicoproteina G che prende contatto con i recettori che, nel VSV, sono dei glicolipidi; questo è quindi un recettore molto diffuso che permette un ampio spettro d'ospite. Per il virus della rabbia invece il recettore usato è quello dell'acetilcolina a testimonianza dell'effetto patogeno nei confronti del sistema nervoso centrale. La rabbia si acquisisce con il morso di un animale infetto ed il virus raggiunge lentamente il sistema nervoso centrale dove determina i sintomi della rabbia. La diffusione dal morso al sistema nervoso centrale è fatta sempre tramite i neuroni ed è molto lenta: quando veniamo morsi possiamo infatti ricorrere ai centri antirabbici che fanno una sieroterapia con anticorpi specifici contro le proteine di questo virus. Essendo il virus lento, gli anticorpi possono proteggerci così da uccidere il virus e salvarci (chiaramente questo dipende anche da dove è avvenuto il morso). Dopo l'adsorbimento abbiamo la penetrazione di questo virus che, a differenza del paramyxovirus, avviene attraverso endocitosi. All'interno dell'endosoma, per acidificazione, abbiamo modificazioni della glicoproteina G che acquisisce un potere fusogeno (dato dalla proteina M) che rilascia il capside, associato al complesso della RNA trascrittasi, nel citoplasma. Qui il virus comincia a trascrivere gli RNA messaggeri che codificano per varie proteine. Le proteine non glicosilate verranno sintetizzate sui ribosomi liberi mentre le glicoproteine verranno sintetizzate sui ribosomi legati al RE subendo poi le loro modificazioni con aggiunta di glicidi per essere poi esposte sulla MP della cellula. Le proteine non glicosilate verranno quindi sintetizzate sul citoplasma e, tra queste, vi saranno le proteine L e P che formeranno complessi di replicazione. La RNA pol prodotta replicherà il genoma tramite intermedi di replicazione, molecola di RNA a pol +, che viene usata come stampo per la sintesi della molecola di RNA a polarità negativa. A questo punto si verifica l'assemblaggio dei virioni: avremo la glicoproteina G a livello della membrana; le glicoproteine vengono riconosciute dalla proteina M, che si posiziona al di sotto, e la proteina M stessa fa da ponte tra le glicoproteine che saranno inserite nell'envelope del virus ed i complessi ribonucleoproteici. Il genoma viene organizzato nel capside elicoidale che si posiziona sotto lo strato della proteina M; le interazioni tra proteina M e N diventano più compatte e conferiscono la caratteristica forma del virus. Il compattamento delle proteine M rappresenta il meccanismo per cui questa membrana modificata subisce il processo di gemmazione, che si completa con il rilascio del virus. Conoscendo il genoma, i cicli sono abbastanza simili perché le strategie sono sempre le stesse e questa è infatti la base della classificazione di Baltimore.

 

Filoviridae (pol -).

Virus molto simili a quelli già visti, sono i virus di questa famiglia. Essi sono virus che hanno una morfologia filiforme da cui prendono il nome. A questa famiglia appartengono patogeni umani molti rilevanti come il virus ebola di cui ne esistono vari tipi. Questo virus per fortuna non è endemico nella popolazione umana, probabilmente è un virus animale, forse dei pipistrelli. Saltuariamente si ha un passaggio di questo virus dal serbatoio animale alla specie umana, causando, quindi, lo scoppio di queste epidemie in varie zone dell'Africa. Questi virus determinano una forma estremamente grave di malattia inducendo delle febbri emorragiche. I soggetti vanno incontro a grosse emorragie perché il virus è molto citotossico, in quanto probabilmente non è ancora adattato all'uomo e quindi, quando incontra l'ospite umano, ha un effetto devastante (mortalità di circa l'80%). I virus che da secoli sono abituati ad infettare l'uomo, si sono anche adattati ad uccidere l'uomo non troppo velocemente per permettere la loro diffusione nell'organismo ospite.

I filovirus sono lunghi circa un micron (molto lunghi) con diametro invece di circa 80nm. Sono così mortali che possono essere manipolati solo in alcune strutture dette di tipo 4 (massimo rischio) con personale altamente addestrato. Sono molto stabili e a temperatura ambiente, a differenza della maggior parte dei virus, possono sopravvivere per oltre 24 ore e riescono a resistere addirittura per 30 minuti a 60 gradi di temperatura. Sono molto simili ai rhabdovirus, hanno un nucleocapside elicoidale che contiene una molecola di RNA a singolo filamento con polarità negativa e presenza di involucro. Il ciclo di replicazione non si conosce ancora nei particolari ma si suppone simile a quello del VSV. Abbiamo anche qui una trascrittasi, una glicoproteina che fa il capside elicoidale, una proteina vp30 (analoga della proteina N), una proteina vp40 che è la matrice di questo involucro e una proteina di fusione, gp, che è la glicoproteina dell'involucro che forma i peplomeri di questo virus. Oltre ad avere una glicoproteina nell'involucro, producono una glicoproteina analoga che viene però secreta in modo tale da eliminare gli anticorpi che non riconoscono le cellule infettate dal virus che presentano la loro glicoproteina in membrana. In una cellula infettata da questo virus abbiamo una forte gemmazione che porta alla morte della cellula, ma si osservano anche una serie di alterazioni che vanno a contribuire alla rapida distruzione della cellula infetta e quindi all'insorgenza della patologia associata.


Virus influenzali (pol -).

Seppure questi virus hanno un'incidenza di mortalità molto inferiore al virus ebola, questi virus, per la loro grande diffusione nel mondo, mietono ogni anno milioni di vittime. Questi virus hanno una forma rotondeggiante anche se vengono definiti pleiomorfi dato che hanno una morfologia varia e non sempre rotondeggiante. Anche loro sono virus con genoma a polarità negativa ss che però è segmentato, una strategia di questo virus per rendere possibile la sintesi di RNA monocistronici. Dal punto di vista strutturale il virus presenta un involucro che conferisce le dimensioni finali del virus di circa 120nm. Vediamo la struttura: abbiamo l'involucro esterno in cui sono inserite le glicoproteine che sono di due tipi, una detta HA (emoagglutinina) ed una detta NA (neuraminidasi). La HA forma trimeri mentre la proteina neuraminidasica forma dei tetrameri. Nei virus parainfluenzali (visti la lezione scorsa) abbiamo visto che è presente invece la HN che ha le funzioni di entrambe le proteine. Al di sotto dell'involucro abbiamo sempre lo strato della matrice. All'interno di questo involucro troviamo i nucleocapsidi virali (plurale perché sono più di uno essendoci segmentazione del genoma) organizzati con simmetria elicoidale da parte della nucleoproteina. Essendo un virus a polarità negativo, anche questo virus deve avere la sua RNA pol o replicasi o trascrittasi (sinonimi).

I segmenti genomici possono essere 8 o 7 a seconda del tipo di influenza che stiamo considerando. La A e B hanno 8 segmenti mentre l'influenza C ha 7 segmenti. Abbiamo quindi diversi virus influenzali. La A infetta l'uomo ma anche altri animali, la B solo l'uomo mentre la C, che è rara, solo gli animali ed ha un segmento genomico in meno rispetto agli altri due tipi di influenze, quindi solo 7. I virus dell'influenza A sono quelli che sono soggetti a maggiori cambiamenti per mutazione che possono, anno dopo anno, reinfettarci. I cambiamenti possono essere minori se rappresentano delle mutazioni puntiformi che derivano da errori della RNA pol virale che non possiede il proof reading; si accumulano quindi mutazioni che possono portare ad un cambiamento antigenico soprattutto delle proteine esterne (HA e NA) che sono quelle che vengono riconosciute dall'organismo. Queste mutazioni puntiformi determinano cambiamenti antigenici minori ma occasionalmente possono capitare anche grossi cambiamenti: in questo caso abbiamo cambiamenti genetici del virus che vedremo nella lezione dei vaccini. Mentre i cambiamenti genetici minori fanno si che ogni anno abbiamo qualche persona che si ammala (che probabilmente non si sono ammalate l'anno prima), se abbiamo invece cambiamenti antigenici maggiori sono gli anni in cui tutti andiamo a letto con l'influenza perché nessuno possiede anticorpi pronti per bloccare questi virus che sono molto mutati e diversi dai soliti che circolano.

Questi virus vengono definiti in modo abbastanza complicato: A sta per il tipo (A, B o C), poi abbiamo il nome del posto dove è stato identificato ed isolato il nuovo ceppo (es. Singapore), poi abbiamo un numero (es. 6) legato al laboratorio che l'ha isolato, poi abbiamo l'anno di isolamento, e H1N1 sono i tipi antigenici delle due proteine HA e NA. Di emoagglutinine ne abbiamo 15 e di neuraminidasi ne abbiamo 9; possiamo quindi avere tutte le combinazioni dato che il virus è segmentato.

L'emoagglutinina è una glicoproteina molto importante per l'infezione e l'adsorbimento (come abbiamo visto nella lezione 4). La neuroaminidasi è invece un enzima che scinde l'acido neuraminico che è l'acido sialico. L'acido sialico non è altro che un polimero 3,4,5 di NAG (N-acetilglucosammina). La neuroaminidasi è importante per le infezioni B che sono virus che vengono acquisiti attraverso la via respiratoria che è ricoperta di muco protettivo. Questo virus, se non avesse neuraminidasi, non potrebbe infettarci perché si legherebbe alle proteine del muco e verrebbe portato fuori. Il virus invece digerisce l'acido sialico dello strato mucoso e riesce a raggiungere l'epitelio del sistema respiratorio usando la sua VAP, che è l'HA, un trimero a sua volta formato da dimeri di HA1 e HA2, il primo che prende contatto con la membrana della cellula mentre il secondo che permette la fusione delle due membrane, tramite una sequenza AA idrofobica.

I virus influenzali di tipo A infettano sia l'uomo che altri animali: i virus umani riconoscono soltanto l'acido sialico legato al galattosio in posizione α2-6, mentre i virus aviari riconoscono l'acido sialico solo quando è legato al galattosio con legami α2-3. Questa differenza è dovuta a diverse sequenze amminoacidiche della HA. I virus aviari, per esempio, hanno subito delle mutazioni che gli hanno permesso di infettare anche l'uomo.


Vediamo il genoma di questi virus. Il genoma è segmentato ed ogni segmento è racchiuso in un capside elicoidale. La proteina NP forma il nucleocapside e, ad ogni segmento o complesso ribonucleoproteico, è legato un complesso di tre proteine PB1 e PB2 (proteine basiche) e la proteina PA (proteina acida) che forma il complesso della RNA pol del virus. Nel genoma del virus ogni segmento codifica per una proteina, una strategia caratteristica di questo virus. Alla fine del 5' abbiamo sequenze poly U che permettono la formazione della coda di poly A quando l'RNA viene replicato. Ogni segmento codifica per una proteina tranne che per gli ultimi due segmenti in cui vengono fuori due proteine ciascuno per splicing: il segmento 7 da la M1 e M2 mentre l'8 da la sintesi di proteine NS (non strutturali) che hanno un grosso significato per la replicazione del virus. Il virus usa quindi anche meccanismi di splicing, e quindi deve replicare nel nucleo, una delle eccezioni dei virus a RNA. Alle estremità 5' abbiamo corte sequenze che servono per formare la coda di poly A dei messaggeri ma il complesso della RNA pol del virus non ha attività metiltransferasica e quindi non riesce a sintetizzare la sequenza cap, cosa che potrebbe portare alla non traduzione dei messaggeri. Questo porta alla seconda ragione per cui questi virus devono replicare nel nucleo, perché questo virus è in grado di rubare i cap dagli mRNA cellulari che vengono sintetizzati dalla cellula. Di fatto abbiamo che la PB1 è legata al capside del segmento del virus, mentre la PB2 ha un'attività endonucleasica che priva il cap dagli mRNA della cellula che stanno venendo trascritti. Sempre la PB2 forma un legame covalente tra cap e RNA genomico del segmento. Questo cap serve come primer del complesso della RNA pol per trascrivere la copia positiva del segmento negativo di RNA virale. Gli RNA vengono quindi in questo modo forniti di cap. Questo porta ad un ulteriore vantaggio in quanto, rubando i cap cellulari, impedisce agli mRNA cellulari il trasporto e la produzione di tali messaggeri.

 

Vediamo il ciclo di replicazione. Abbiamo l'adesione del virus sulla membrana attraverso il riconoscimento della HA al recettore dell'acido sialico. Il virus entra in una vescicola endosomiale che subisce acidificazione, che induce cambi conformazionali alla proteina HA che presenta il peptide fusogeno, il quale era ripiegato all'interno del trimero di HA; questo cambio espone il peptide fusogeno che si inserisce nelle membrane dell'endosoma fondendo e rilasciando i vari segmenti (vedi lezione 4 per maggiori dettagli). I segmenti sono ricoperti dalla proteina NP che contiene delle sequenze di localizzazione nucleare e quindi essi vengono trasferiti nel nucleo dove avviene la trascrizione; gli mRNA traslocano nel citoplasma e vengono tradotti sui ribosomi liberi per le proteine non glicosilate mentre sui ribosomi del RE per le glicoproteine. Anche in questo caso abbiamo nuove proteine replicative e quindi è possibile fare la replicazione del genoma attraverso la sintesi dei vari segmenti di RNA a polarità positiva che poi, quando rivengono trascritti, danno di nuovo i segmenti del genoma virale: Questi segmenti andranno a posizionarsi sotto la membrana plasmatica nelle zone in cui si sono inserite le glicoproteine e si è inserita la proteina M: quindi, esattamente con lo stesso meccanismo di compattamento delle M (visto precedentemente), avremo la gemmazione del virus. Per questa gemmazione è importante anche in vitro la funzione della NA. Questo virione, senza NA, appena gemmato si riattaccherebbe immediatamente di nuovo sulla membrana della stessa cellula. La NA impedisce, con la sua azione di degradazione dell'acido sialico, il riciclo del virus sulla stessa cellula.

Una particolarità di questo virus è la seguente: se viene aggiunto il cap nell'RNA genomico, se la trascrittasi cominciasse a replicare dal cap, si creerebbe un segmento genomico più lungo: ci deve essere quindi un meccanismo che permetta la perdita delle sequenze a monte. C'è quindi un meccanismo che fa si che la RNA pol, quando replica la copia di RNA negativo, sia impedita a legarsi agli mRNA con cap che quindi non vengano usati per la replicazione del genoma. Come avviene per i paramyxovirus e per i rhabdovirus, anche per i virus influenzali il passaggio tra la fase trascrizionale e quella di replicazione è governato dai livelli di proteina NP o N (sinonimi). Quando ci sono molte proteine c'è un segnale che induce la replicazione del genoma, in cui la polimerasi virale acquisisce la capacità di iniziare la sintesi senza primer. Se ci sono invece poche proteine avremo un segnale di produzione di mRNA in cui si ha richiesta di PB2 per legare il cap e assenza di funzione della PA. Questo meccanismo è governato nei virus influenzali da un cambio di funzione della polimerasi: per fare gli RNA messaggeri serve solo la proteina PB1 e PB2 mentre per fare gli RNA genomici serve anche la funzione della proteina PA.

 

Reoviridae (RNA a doppio filamento).

L'unica famiglia di virus a RNA a doppio filamento è quella dei reovirus (respiratory enteric orphan virus) che sono virus che danno patologie respiratorie ed enteriche (150 tipi). Questi virus hanno un genoma segmentato (10-11) a RNA a doppio filamento con ogni segmento che codifica per una proteina. Sono virus a capside icosaedrico doppio, ovvero hanno due strati capsidici uno su l'altro che racchiudono il nucleocapside in cui risiede l'RNA; non hanno chiaramente envelope. Il più studiato è il rotavirus che da una patologia enterica molto rilevante specialmente nei bambini. Anche questo virus, solo nel mondo non sviluppato, cause molti morti. Esso da una diarrea molto forte che può portare a morte. Questi virus vengono acquisiti dalla cellula tramite endocitosi e sono gli unici virus a rimanere nell'endosoma fino a livello del lisosoma. Questi virus non hanno un meccanismo legato all'acidificazione. Quando si raggiunge lo stato di endolisosoma si degradano i due strati superiori e si mantiene solo il nucleocapside che contiene gli RNA e la RNA pol associata ai vari segmenti. Da questa particella subvirale la polimerasi si attiva e inizia la trascrizione usando come stampo l'RNA di polarità negativa. Questi RNA vengono sintetizzati dentro un piccolo capside icosaedrico che ai 12 vertici ha un foro da cui possono fuoriuscire gli mRNA che si legano ai ribosomi e codificano per le varie proteine. Quando si sono formate le varie proteine (circa 10-11 proteine per 10-11 segmenti), queste proteine ricostituiscono delle particelle subvirali in cui viene incorporata una molecola di RNA messaggero che, insieme alla RNA pol, trascrive questa molecola di RNA messaggero per riformare il genoma a doppio filamento. Non hanno glicoproteine e quindi la loro maturazione avviene in zone della cellula, come il reticolo endoplasmatico, dove le particelle subvirali vengono completate per autoassemblamento dei due strati sovrastanti di capsidi icosaedrici che poi escono tramite lisi della cellula o tramite esocitosi.

Retrovirus (pol + diploide).

I retrovirus hanno una morfologia sferoidale con envelope di 100 nm in cui sono inserite delle glicoproteine. All'interno dell'envelope, oltre lo strato di matrice, troviamo un capside con una forma particolare tronco-conica. Questa forma deriva dalla fusione tra due capsidi icosaedrici ai due estremi del poro, uniti insieme da un capside elicoidale formato dalla proteina capsidica. All'interno di questo capside troviamo due molecole di RNA a singolo filamento di polarità positiva (genoma diploide) accompagnati da proteasi, trascrittasi inversa e integrasi. A livello dell'involucro il virus HIV presenta una glicoproteina detta gp120, una proteina di superficie che è mantenuta nell'involucro dall'associazione non covalente con la glicoproteina gp41. La proteina di matrice è detta MA mentre la proteina capsidica è la proteina p24. All'interno troviamo i due genomi di RNA a polarità positiva associati con la trascrittasi inversa, la proteasi e l'integrasi. Le funzioni di queste glicoproteine sono importanti: gp120 è la VAP del virus che prende contatto con la superficie della cellula da infettare e come recettore usa il cd4 che caratterizza i Ly T helper cd4 ma che è anche presente in macrofagi e cellule gliali del sistema nervoso. Disturbi neuronali sono infatti spesso associati alle prime fasi di infezione di questo virus. Quando abbiamo fatto la penetrazione del virus nella lezione 4, abbiamo visto come non è sufficiente un unico riconoscimento con cd4, ma la gp120 deve riconoscere anche un'altra molecola che è CXCR4 o CCR5; il CXCR4 è presente sui Ly T helper mentre il CCR5 è un corecettore presente sui macrofagi che permette l'adsorbimento e la penetrazione del virus nei macrofagi. Questo legame è lo step chiave per distinguere il tropismo di questo virus. Nelle prime fasi di infezione si infettano prima i macrofagi dove il virus replica abbondantemente. Essi muoiono solo 15 giorni dopo l'infezione quindi si produce molto virus e si infettano anche i Ly T helper grazie a mutazioni che sopraggiungono a livello della gp120 a causa della non efficienza della RNA pol. Quando il virus infetta i Ly T cd4 avremo una fase lunga anni che porta infine a morte.

Il genoma dei retrovirus è formato da due molecole identiche di RNA a polarità positiva (virus diploidi). Queste molecole sono legate insieme da legami a idrogeno in un sito detto di kissing loop. Un'altra caratteristica di questi genomi è che hanno una regione di legame ad un RNA transfert (regione PBS) che deriva dalla cellula che hanno infettato, generalmente il tRNA della lisina per l'HIV o di altri AA per altri retrovirus. L'unione che c'è tra queste due molecole contribuisce ad una grossa variabilità del virus in quanto, grazie al processo della retrotrascrizione, possiamo avere il fenomeno della ricombinazione che aumenta la variabilità genetica del virus. La gp120 costantemente muta e quindi non abbiamo anticorpi che sono in grado di fermarla in maniera efficiente, per questo non esiste un vaccino. Avere queste due molecole identiche che subiscono lo stesso processo di retrotrascrizione è uno dei fenomeni per cui questo virus varia costantemente.

Abbiamo visto l'adesione della gp120 con il recettore ed il corecettore (lezione 4); questa doppia interazione con le due molecole fa si che ci siano dei cambiamenti conformazionali della gp120 che si sposta leggermente ed espone la gp41 che ha una sequenza idrofobica che riesce ad inserirsi nella membrana della cellula; attraverso delle interazioni la gp41 avvicina le due membrana che fondono con un meccanismo di fusione pH indipendente. Nel citoplasma viene rilasciato il capside tronco-conico che subisce un parziale disassemblamento per diventare un complesso di pre-integrazione. All'interno di questo complesso avviene la trasformazione di queste molecole di RNA in una molecola di DNA a doppio filamento con un processo che è quello della trascrizione inversa. Si usa come inizio della retrotrascrizione proprio il tRNA primer visto prima che è legato in una sequenza specifica del genoma di RNA positivo; si sintetizza quindi una molecola di DNA usando come stampo l'RNA.

Le due estremità della molecola di DNA presentano regioni ripetute identiche (sequenze R) sia al 5' che al 3'. Tali sequenze ripetute sono succedute da delle sequenze uniche(sequenze U3 e U5) diverse tra 5' e 3'. Quando U5 e U3 sono retrotrascritte ad entrambi gli estremi della molecola di DNA provirale, la quale risulta perciò più lunga dell’RNA genomico, l’insieme U3-R-U5 presente ad ogni estremo del DNA provirale forma il cosiddetto “LTR” (Long Terminal Repeat), che contiene il promotore e l’enhancer necessari per la trascrizione del provirus.

Dopo la sintesi del primo filamento di DNA (polarità -), la trascrittasi inversa, che è una proteina che presenta sempre un'attività di RNasi (RNasi H), cleava all'estremità 5' la molecola di RNA che è stata appena copiata. Poiché la degradazione avviene solo parzialmente, i frammenti restanti vengono a loro volta usati come inneschi per la sintesi del secondo filamento di DNA. Si viene quindi a formare una molecola di DNA che ha la possibilità di complementarsi ed attaccarsi all'estremità 3' del genoma virale dando luogo al primo scambio templato. Inizia la sintesi dell'elica di DNA complementare (DNA +) fino a giungere ad una molecola di DNA a doppio filamento. La molecola a doppio filamento che si forma sarà circolare e con le estremità al 5' (U3-R-U5) appaiate. Durante la retrotrascrizione si vengono infatti a scambiare le sequenze al 3' con il 5'. Si viene ad aggiungere una sequenza U3 al 5', come anche una sequenza U5 al 3'. Si viene quindi a creare una sequenza detta LTR (long terminal repeats) che è fondamentale per il processo di integrazione del virus nel DNA della cellula. Il DNA, una volta replicato, entra quindi nel nucleo della cellula attraverso meccanismi che non vedremo. Due molecole di integrasi mediano l'entrata del DNA virale nel genoma della cellula con un meccanismo semplice in cui l'integrasi taglia due nucleotidi all'estremità 3' di entrambe le molecole di DNA e poi, come un cuneo, integra questo DNA dentro il DNA della cellula. La rottura del DNA determina una perdita di poche basi (3-4 a livello del DNA della cellula ospite) che vengono ricucite dagli enzimi cellulari. Il DNA virale quindi si integra nel DNA della cellula e lì rimane stabilmente. L'integrazione nel DNA cellulare è casuale.

A questo punto inizia la trascrizione del virus integrato. Una volta che il DNA del virus è integrato inizia la trascrizione governata dalle sequenze LTR che sono sequenze di riconoscimento di fattori trascrizionali tra cui una proteina virale tat che è importante per una efficiente trascrizione del provirus. Si formano tre tipi di RNA di peso molecolare diverso. Abbiamo le due sequenze LTR e poi all'interno il classico genoma di un retrovirus organizzato in tre blocchi genici, gag, pol ed env.

virologiaDa env si generano per splicing i messaggeri per la sintesi delle glicoproteine. La trascrizione parte sempre dalle LTR; parte la trascrizione dalla LTR, si ha doppio splicing e si hanno i messaggeri per env che viene sintetizzato come precursore, gp160che poi viene cleavata nelle due proteine gp120 e gp41 a livello della membrana citoplasmatica da parte di proteasi cellulari. L'RNA è di 2,4kb, quindi corto. Poi abbiamo altri RNA di 4,5kb che servono per la sintesi delle proteine gag e pol. Le proteine gag sono proteine strutturali che codificano per le proteine della matrice e del capside che si formano tramite processamento proteolitico del precursore gag. Per una fase di lettura differente dallo stesso RNA si possono formare le proteine del gene pol che sono l'integrasi, la trascrittasi inversa e una proteasi che permette il cleavaggio delle proteine gag e pol. La proteasi è attiva anche in forma di precursore (come abbiamo visto pure per il poliovirus) e, quindi, appena viene sintetizzata, si attiva e si autocleava diventando una proteasi libera che può andare a cleavare le altre proteine, gag e pol. Il genoma comunque codifica anche per una serie di proteine accessorie che hanno vari nomi e servono per facilitare la replicazione di questo virus, come la tat che serve per la trascrizione. All'inizio la trascrizione è inefficiente ma solo quando si forma la tat inizia la vera trascrizione del genoma, in quanto tat aumenta di circa 50-100 volte l'efficienza della trascrizione. Anche la proteina rev è importante in quanto durante la trascrizione si formano RNA che non hanno subito splicing e che quindi non vengono trasportati all'esterno del nucleo. Rev serve per trasportare fuori dal nucleo gli RNA che non hanno subito splicing.

Quando il genoma deve replicare si forma il terzo tipo di RNA, un RNA lungo quanto tutto il provirus (9-10kb) tranne alcune sequenze terminali: in pratica dalla sequenza R alla sequenza R lasciando la U3 e la U5. Questi RNA, grazie alla proteina rev, vengono portati all'esterno del nucleo. L'RNA viene incapsidato dalla proteina nuleocapsidica ch riconosce le code citoplasmatiche delle proteine che si sono inserite in membrana, la gp160 che segue un cleavaggio indipendente, ma anche le proteine gag come precursore, quindi: la proteina che forma lo strato della membrana, la proteina che forma lo strato capsidico e la proteina che andrà a formare il complesso ribonucleoproteico. L'RNA del virus riconosce la proteina che deve incapsidarlo che è la N, che è legata alla membrana tramite questa poliproteina. Ugualmente sono inserite in membrana il precursore del gene gag e del gene pol. La proteasi si attiva e cleava se stessa e le proteine. La maturazione si ha quando il virus stesso sta per gemmare. Al di fuori della cellula infetta si possono osservare anche virus non maturi in quanto il cleavaggio da parte della proteasi può avvenire anche quando il virus è uscito fuori dalla cellula.

 

(Si ringrazia Alex S. per la revisione)

 

Virologia

 

Infezioni virali                                                                                                   Lezione 8 del 22.11.07

 

Effetto citopatico.

Esso è il risultato cumulativo di quello che è il meccanismo di replicazione e di espressione delle proteine del virus. L'infezione può essere analizzata a livello di cellula e a livello di organismo, nel primo caso avremo effetto citopatico mentre nel secondo una patologia virale.

A livello di cellula osserviamo una alterazione della morfologia cellulare che prende il nome di effetto citopatico; esso è progressivo e va avanti con la replicazione del virus. Le alterazioni coinvolgono la membrana della cellula a causa di tutte le glicoproteine del virus che vi si vanno a localizzare. Essa viene alterata acquisendo permeabilità agli ioni: quindi gli ioni esterni tendono ad entrare all'interno cambiando l'ambiente cellulare e facilitando la lisi della cellula. La replicazione del virus avviene sempre in zone più o meno definite, dove vi sarà accumulo di materiale di derivazione virale come RNA, DNA e proteine. All'interno di cellule infettate possiamo quindi osservare ammassi proteici e di acidi nucleici che contribuiscono alla modificazione della morfologia della cellula. In virologia queste modificazioni sono dette corpi inclusie possono essere citoplasmatici o nucleari. Essi sono stati un modo per diagnosticare delle infezioni virali come nel caso delle infezioni di rabbia post-mortem.

Se il virus presenta proteine di fusione come la F dei paramyxovirus che fonde a pH neutro, o la gp41 del virus HIV, abbiamo delle alterazioni che dipendono da queste proteine di fusione che possono causare la fusione anche con cellule vicine dando sincizi di cellule. Tutti i virus possono, con varie strategie, acquisire il potenziale biosintetico della cellula in cui tutti gli enzimi che fanno nucleotidi ed altro vengono sfruttati dal virus a discapito della cellula. Il virus usa i ribosomi cellulari per i suoi RNA impedendo agli RNA cellulari di essere tradotti. Generalmente questi virus hanno strategie come quella del cap del virus influenzale che permettono la traduzione; in generale tutti i virus hanno meccanismi per sfruttare al meglio i ribosomi cellulari.

Il virus polio, ad esempio, impiega solo 8 ore per distruggere la cellula e quindi riesce bene a prendere il sopravvento sui meccanismi della cellula. Esso codifica per una proteasi, la 2A, che serve, oltre che al processamento delle proteine virale, anche a cleavare la proteina p220 che fa parte del complesso del riconoscimento del cap degli mRNA. Con questo taglio il complesso non riconosce più gli RNA che hanno il cap e quindi sui ribosomi non possono più andare gli RNA cellulari che hanno il cap; gli RNA del poliovirus hanno però la sequenza IRES che riesce comunque a legare i ribosomi indipendentemente dal complesso d'inizio. Il risultato di tutte le alterazioni biochimiche è che la cellula infetta subisce degradazione del citoscheletro e quindi da adesa si arrotonda, si distacca dal substrato e si ha lisi o apoptosi: quindi effetto citopatico.

 

 

 

Trasformazione.

Le stesse alterazioni morfologiche in vitro possono essere osservate anche in vivo. In alcuni casi non osserviamo l'effetto citopatico ma osserviamo invece una proliferazione eccessiva delle cellule. Cellule di topo infettate da un retrovirus danno luogo ad un aumento della replicazione cellulare. In questo caso il virus induce trasformazione. La trasformazione può essere indotta con vari meccanismi. Abbiamo tre meccanismi che sono l'inibizione dei meccanismi antioncogenici della cellula (la cellula ha proteine che controllano il ciclo di replicazione della cellula che, se va male, mandano la cellula in apoptosi). Alcuni virus riescono quindi ad interferire con questi meccanismi. Altri virus invece codificano per proteine omologhe ai geni onc, ovvero oncogeni, che sono proteine cellulari che possono dare trasformazione. Terzo meccanismo è l'integrazione che può essere causata dai retrovirus che, inserendosi a caso o in punti particolari, possono dare trasformazione. Quindi un altro evento che può capitare quando infettiamo una cellula con un virus è la trasformazione.

Ripetendo: ci possono essere vari modo in cui un virus può trasformare una cellula. I virus a DNA, nella loro replicazione, producono specifiche proteine che possono inibire degli antioncogeni cellulari che controllano la proliferazione e l'apoptosi della cellula; altri virus come quelli a RNA, in particolare i retrovirus, determinano la trasformazione con meccanismi particolari, come quello in cui nel loro genoma sono presenti geni onc (oncogeni), oppure possono trasformare la cellula integrandosi nel cromosoma della cellula in siti che codificano per proteine oncogeniche o protooncogeniche.

Gli adenovirus ed i papovavirus (papilloma e poliomavirus) inibiscono la proteina pRB (proteina del retinoblastoma). Questa proteina nella cellula normale è deputata a mantenere inattivo il fattore trascrizionale E2F. E2F è liberato dalla pRB quando essa si stacca in seguito a fosforilazione da parte di una chinasi ciclina dipendente (serve per il ciclo cellulare). Il fattore di trascrizione E2F va ad attivare la trascrizione di geni importanti per la replicazione cellulare, come le cicline ed altri geni deputati per la sintesi del DNA. Quando E2F è libero, la cellula replica. L'adenovirus codifica per E1A mentre il poliomavirus codifica per la proteina T large (che abbiamo già visto e che serve anche nella replicazione del DNA) mentre il papilloma codifica per la proteina E7: queste tre proteine legano la proteina del retinoblastoma, associandosi ad essa e distaccando la proteina dal fattore E2F che sarà sempre libero mandando di fatto la cellula verso la replicazione. Questi virus riescono ad indurre la replicazione della cellula: è una strategia virale poiché, essendo virus a DNA, essi devono replicare il loro DNA. Una cellula che deve replicare il suo DNA ha tutti gli enzimi necessari perché possa avvenire la sintesi di DNA (quindi DNA pol ma anche altri enzimi che cooperano l'attività sintetica della DNA pol come quelli per l'assunzione di nucleotidi dall'esterno che sono indotti nel passaggio della fase S). Questi virus codificano proteine con funzioni specifiche per il virus: esse si sono evolute in questo senso poiché, essendo prodotte da virus a DNA, fanno si che nel nucleo della cellula trovino tutti gli enzimi e i nucleotidi necessari per la replicazione del loro genoma. La stessa situazione la troviamo con p53, proteina antiapoptotica. Un virus a DNA che replica nel nucleo deve replicare il suo genoma; questo porterebbe uno stimolo di allerta nella cellula, uno stimolo proapoptotico dato che p53 capta danni a livello della cromatina, e del DNA estraneo presente nel nucleo potrebbe attivare il pathway di p53. Esso è un fattore trascrizionale, responsabile della sintesi ed espressione di proteine proapoptotiche. Questi virus non vogliono che la cellula vada in apoptosi e quindi di nuovo abbiamo delle proteine che sono in grado di impedire l'attivazione di p53; sono proteine che lo complessano, come la proteina E6 del papillomavirus, la proteina LT (credo sempre la proteina T Large) del poliomavirus, e la proteina E1B dell'adenovirus. Esse Intrappolano p53 e non fanno avvenire l'apoptosi. Particolarità della proteina E6 del papillomavirus è invece quella di indurre la degradazione di p53.

Meccanismo diverso è quello operato dai retrovirus. Possiamo distinguerli in retrovirus trasducenti e non trasducenti. Partiamo dai primi: i genomi dei retrovirus sono organizzati con tre geni: gag, pol ed env fiancheggiati dalle sequenze LTR. Esistono tanti retrovirus diversi con effetti oncogeni (non ne esistono di umani per fortuna). Tutti questi retrovirus hanno incorporato nel loro genoma un oncogene cellulare (probabilmente di derivazione cellulare), come la proteina sarc, quella del retinoblastoma, la proteina mic, la proteina ras ecc... Quando questi retrovirus infettano una cellula, portano questi oncogeni causando la trasformazione della cellula. Questi retrovirus però mancano di un pezzo di genoma, sono quindi difettivi proprio perché portano questi oncogeni. Essi si integrano e cominciano la loro trascrizione senza la formazione di virioni perché sono difettivi e non riescono a compiere tutto un ciclo virale, ma trasformano la cellula. C’è un altro meccanismo con cui i retrovirus possono trasformare una cellula, e questo può essere attuato da tutti i retrovirus, indipendentemente dal loro genoma; in questo caso parliamo di retrovirus non trasducenti. Essi possono integrarsi nella cellula e, se lo fanno in posti particolari, come promotore o enhancer di un protooncogene cellulare, possono disregolare l'espressione di questo gene portando a trasformazione. Se il retrovirus si integra in una regione del promotore possiamo avere dei trascritti di fusione, con una parte virale ed una parte cellulare, ma il concetto importante è che questa parte di DNA cellulare codifica per una proteina protooncogenica. Per fare un trascritto di fusione si ha però la delezione di una parte del provirus. La regione LTR del provirus ha una trascrizione non regolata o ha le sue regolazioni, indipendenti dalle regolazioni della cellula ospite; l'inserimento di LTR determina il cambio trascrizionale del protoncogene cellulare. Se l'inserzione avviene in un enhancer di un protooncogene, abbiamo soltanto l'aumento dei trascritti cellulari e non abbiamo trascritti fusi; si ha solo l’attivazione trascrizionale di questo gene.

 

Vie di trasmissione dei virus.

Vediamo quali sono le vie di trasmissione dei virus: possono entrare nel nostro organismo attraverso l’apparato respiratorio (via aerea), possono anche penetrare attraverso l'apparato digerente (trasmissione orofecale), apparati genitali, mucose esterne come quelle dell'occhio ma anche l'epidermide e quindi per contatto diretto o per via parenterale, come punture di insetti o aghi e trasfusioni. La via area è la via più comune di infezione. La superficie polmonare è 140 metri2, e per via area i virus possono penetrare o direttamente per aerosol (starnuto o tosse) respirando l’aria che contiene queste particelle, o perché queste particelle si depositano su una superficie e, se dopo poco tempo veniamo a contatto con questa superficie infetta, possiamo portare il virus tramite le mani vicino al sito di penetrazione. L'influenza ed i rhinovirus possono avere trasmissione sia per aerosol che per contatto diretto. L'infezione avviene nonostante la presenza di numerose difese meccaniche come le secrezioni mucose (ricorda meccanismo dell'influenza) e le cellule ciliate, ma anche di macrofagi alveolari e IgA. Le nostre mucose orali sono caratterizzate infatti anche dalla presenza di anticorpi della classe IgA, che sono anticorpi secretori che si trovano nei liquidi di queste mucose e sono la nostra prima possibilità di difesa contro i virus se abbiamo avuto già un contatto precedente. Le sedi in cui vari virus possono infettare possono essere trachea, bronchi ed alveoli polmonari. I rhinovirus (raffreddore) infettano solo le mucose del naso. Le faringiti possono essere causate dagli adenovirus (isolati infatti nelle adenoidi), mentre le laringiti da virus parainfluenzali. Virus diversi possono causare patologie diverse cosa che dipende dai meccanismi del virus. L'insieme delle proprietà biologiche del virus si chiama tropismo (capacità di infettare solo certe cellule o solo certe sedi). Ad esempio i rhinovirus infettano solo le mucose del naso e non possono penetrare più internamente perché vivono a temperature di 35 gradi (a 37 gradi già non possono più replicare). La trasmissione orofecale ha condizioni particolari: i virus che si trasmettono in questo modo devono avere una struttura in grado di resistere al pH dello stomaco. Anche le pareti dell'intestino sono ricoperte da villi che sono anche loro un ottimo meccanismo di difesa meccanico, anche se alcuni virus, come gli adenovirus, i rotavirus, gli enterovirus ed altri, replicano in questa sede. La trasmissione orofecale è causata dal mangiare o dal mettere in bocca delle cose contaminate dal virus. Dopo l'infezione andiamo incontro a malattia che non sempre è sintomatica ma può essere anche lieve tanto da passare inosservata.

 

Infezioni virali.

Malattia acuta è quella che causa sintomatologia. La manifestazione di segni clinici di malattia dipendono dalle proprietà biologiche del virus e quindi si parla di virulenza del virus che, più è virulento più da malattie. Un virus virulento causa quindi una malattia rilevante mentre un virus avirulento o attenuato non causa malattia o determina una patologia lieve. La virulenza dei virus dipende dal tipo dei virus, dalla dose introdotta (quantità di virus), dalla via di trasmissione (se ingeriamo ad esempio un rhinovirus non succede nulla) e poi dall’influenza del sistema immunitario dell'ospite (se l'ospite ha già anticorpi contro il virus, l'infezione può avvenire ma sarà lieve).

Vediamo un esempio di virulenza. Basta una proteina per dare virulenza. Vediamo i rhotavirus che sono reovirus, virus di solito poco virulenti che infettano l’apparato respiratorio o il tratto gastroenterico. I rhotavirus, sempre membri di questa famiglia, possono dare manifestazioni cliniche evidenti in bambini e persone molto anziane. Questo virus ha un meccanismo patogenetico molto efficace: essi codificano per NSP4, una proteina non strutturale del virus. Nei nostri enterociti (cellule del sistema enterico) questa proteina si trasforma in una enterotossina che innesca un meccanismo di secrezione di ioni calcio e ioni cloro attraverso una segnalazione (traduzione del segnale) che causa infine diarrea. Gli enterociti iniziano questa secrezione che causa la base della manifestazione clinica associata a questa infezione (analogo all'effetto del colera seppure il meccanismo è diverso). Virus virulenti sono anche quelli che distruggono cellule e tessuti.

Bisogna distinguere il tipo di infezione: le infezioni possono essere localizzate,quando rimangono nel sito di penetrazione come nel caso dell’influenza che infetta gli alveoli ma li si ferma. Altre infezioni possono essere disseminate o sistemiche quando coinvolgono varie parti dell'organismo. Quelle disseminate o sistemiche derivano da un meccanismo virale in cui dal sito dell'infezione localizzata, che corrisponde di solito al sito di entrata, il virus, attraverso il sistema linfatico (es. linfonodi) può arrivare al circolo ematico causando una viremia che poi scende con la comparsa degli anticorpi. Il virus, dopo la viremia, si trova in altri distretti come nella laringe, nel cervello (causa encefalite), nei muscoli ed in altre parti del corpo. Attraverso la viremia il virus riesce ad infettare altri organi.Dal sito di infezione iniziale e localizzato (infezioni asintomatiche o con lieve sintomatologia) i virus possono diffondersi attraverso il circolo ematico tramite viremia.

Nella viremia il virus può esser libero, come virioni, o in fvirologiaorma cellula mediata all'interno di monociti generalmente, o linfociti. Tutti gli organi possono essere coinvolti, ma normalmente sono organi legati al sistema linfatico o molto irrorati. Attraverso questa viremia il virus arriva in questi organi dove si replica e di nuovo raggiunge il circolo ematico facendo una viremia secondaria. La viremia primaria coinvolge pochi virioni perché è causata da una prima replicazione, mentre nella viremia secondaria avremo una quantità maggiore di virioni. Attraverso questa viremia secondaria il virus diffonde al suo organo bersaglio. Un poliovirus in passato determinava (adesso c'è la vaccinazione) una paralisi flaccida in una percentuale rilevante di soggetti a causa della distruzione dei motoneuroni dei muscoli che venivano infettati. Il neurone veniva distrutto e il muscolo senza innervazione dava questa paralisi. L'infezione avviene attraverso la via orofecale, il virus si replica prima negli enterociti causando una lieve forma enterica (diarrea), e, dal sistema intestinale, attraverso strutture linfatiche presenti a livello intestinale, ovvero le placche del Peyer, raggiunge il circolo linfatico facendo la sua viremia primaria. A seguito della prima viremia va ad infettare fegato e milza dove si replica e fa la viremia secondaria infettando anche il cervello, dato che riesce a superare la barriera ematoencefalica. Nel cervello può andare a colpire i centri della respirazione, cosa che quindi rende necessario l'uso del polmone artificiale, oppure può colpire i neuroni motori.

Nel vaiolo murino il virus penetra tramite l'epidermide, e attraverso il circolo linfatico fa viremia; la viremia è necessaria per infettare milza e fegato dove abbiamo moltiplicazione e seconda viremia che causa infezione di nuovo dell'epidermide. In questa seconda fase di infezione del derma abbiamo la malattia vera e propria (poxvirus) che causa pustole rosse in tutto il corpo causando il vaiolo.

Il tipo di malattia dipende dal tropismo del virus. I picornavirus sono una famiglia con 2 generi, enterovirus e rhinovirus: gli enterovirus comprendono poliovirus, coxsackie, ECHO, ed epatite A. Il polio può causare anche poliomelite. Il poliovirus è neurotropo, mentre l'enterovirus 72 da epatite e quindi colpisce il fegato anche se sono virus identici della stessa famiglia.

 

Infezioni croniche o latenti.

In alcuni casi l'infezione acuta può divenire cronica o latente. Le infezioni croniche possono essere stabilite da virus che hanno la capacità di replicare mantenendo un equilibrio con la cellula: questi virus non sono infatti molto citocidi, o sono virus che potrebbero essere citocidi ma che si trovano in condizioni particolari come nel caso di infezioni semipermissive che causano bassa replicazione. Possiamo pure avere anticorpi o interferone che possono impedire la replicazione, oppure possiamo avere virus difettivi che quindi non si replicano bene. La replicazione del virus è quindi bassa ed il virus non uccide la cellula che sostiene cronicamente l'infezione. Questi virus che possono dare infezioni croniche possono dar luogo, con la loro replicazione lenta e costante, a malattie degenerative progressive. Il morbillo è una malattia acuta dovuta ad un paramixovirus. L'infezione del morbillo avviene per via aerea e la prima sede di replicazione è proprio la laringe. Poi va in circolo ematico causando viremia, dove va ad infettare le arteriole che vascolarizzano l'epidermide. Le infezioni delle arteriole (delle cellule endoteliali) fanno si che si abbia lo sviluppo dei segni classici del morbillo ovvero pustole ed arrossamenti causati dalla risposta infiammatoria. Il morbillo di solito si ha nei primi anni di vita ma, in alcuni casi, questi virus replicando nel nostro organismo durante l’infezione acuta, diventano difettivi perdendo i geni M che servono per la gemmazione. Non abbiamo più quindi virus in circolo, ma negli anni (circa a 20-25 anni) possiamo avere la sindrome encefalite subacuta sclerosante, che porta alla distruzione del sistema nervoso e a morte, dovuta alla infezione di morbillo che era rimasto dando un'infezione cronica.

virologiaDiverse sono le infezioni latenti. Possono farle solo i virus erpetici. Nelle infezioni latenti il virus non replica per niente. Il virus non replica per niente ma può riattivarsi. L'esempio è quello dei virus erpetici che infettano in età precoce e replicano, spesso senza dare malattia, con una infezione asintomatica nelle cellule della mucosa del cavo orale. Questi virus possono però infettare i neuroni: dalla sede orale, attraverso i neuroni che innervano questa sede, vanno nei neuroni e tramite un movimento centripeto arrivano ai gangli come quelli oculari e di altri tipi. Con meccanismi molecolari che sono solo in parte stabiliti, in questi gangli il virus non si replica ma rimane in forma episomale nel nucleo dei neuroni. In seguito a certi eventi il virus può riattivarsi e tornare in maniera centrifuga nella sede del neurone, incominciando il nuovo ciclo di replicazione per poi tornare nel ganglio e ristabilire la latenza. Tutte le persone hanno il virus latente, mentre solo alcune hanno l'herpes labiale.

 

Patogenesi delle malattie virali.

La malattia può essere dovuta ad un danno che il virus produce replicando nelle cellule che ha infettato, con effetti come lisi o apoptosi, come nel caso del virus della linfopoliomeningite del topo in cui abbiamo nei topi neonati infezioni della ghiandola pituitaria che viene distrutta, causando la mancata produzione di ormone della crescita e infine morte, quindi un danno diretto. Molte volte il danno può essere indiretto come nel caso delle manifestazioni del morbillo che sono causate dalla risposta dell'ospite e dalla risposta infiammatoria, come per la produzione di interleuchine che fanno parte della risposta dell'ospite. L'infezione virale è quindi associata ad una immunopatologia. La distruzione di un tessuto può essere dovuta al sistema immunitario stesso dell’ospite che attiva cellule citotossiche come i Ly T citotossici o cellule NK, che vengono attivate dalle stesse interleuchine andando a distruggere le cellule che mostrano antigeni virali (non self), causando la distruzione del tessuto. Le infezioni causate dal virus dell'epatite B e dal virus dell'epatite C possono dare infezioni prima acute e poi croniche. Essi sono entrambi virus poco citopatici che non distruggono l'epatocita con la loro replicazione, ma, nelle infezioni croniche, abbiamo invece una distruzione del fegato causata dalla risposta dell'ospite. Le epatiti sono accompagnate da vari sintomi come l'itterizia, dovuta alla distruzione di cellule epatiche e liberazione di bilirubina che non viene eliminata causando la colorazione gialla dell'epidermide. Questa è già una distruzione in fase acuta dovuta non dalla replicazione del virus di per sé, ma dalla risposta dell'ospite data dalle cellule citotossiche. Durante un'infezione cronica avremo una costante distruzione delle cellule degli epatociti, che, quando vengono distrutti, potrebbero rigenerare; sfortunatamente durante il processo di rigenerazione, ad un epatocita si sostituisce spesso una cellula del sarcolemma. Per concludere quindi, nelle infezioni croniche dovute dalla risposta dell’ospite, abbiamo una sostituzione delle cellule del fegato con ammassi di cellule fibroblastiche che causano irrigidimento del tessuto e che vanno a costringere vene come quella portale. Questo da una parte porta allo sviluppo di ascite come extravasione e versamento di liquidi nel sangue nella cavità peritoneale, ed infine porta a cirrosi, ovvero malfunzionamento del fegato che è distrutto. Tutto questo è causato dalla risposta dell’ospite e non dalla replicazione del virus.

 

Risposta antivirale innata (IFN).

Abbiamo anche una risposta mediata da interleuchine che cercano di mitigare l'infezione come l'interferone. Gli interferoni (IFN) sono glicoproteine identificate 50 anni fa, che vengono prodotte in risposta alle infezioni virali. Se si prendeva il terreno di coltura con cellule dove si era sviluppato virus influenzale e si distruggeva il virus, con pH acido ad esempio, questo terreno, riportato a pH neutro e posto su nuove cellule che venivano infettate con virus influenzale, ne impediva l'infezione. Vennero quindi identificate queste glicoproteine di peso molecolare intorno ai 20KDa. Sono stati identificati due tipi di interferone diversi nella loro funzione: c'è l'IFN di tipo 1 che comprende l’interferone α e β. Per α sono stati identificati circa una 20 di geni umani che codificano per questa glicoproteina mentre per l’interferone β esiste solo un gene. Quelli di tipo 1 sono responsabili dell'azione antivirale. L'interferone di tipo 2, detto anche immune o γ, svolge più una funzione di interleuchina che regola ed attiva le cellule del sistema immunitario come NK e cellule T. Questa risposta interferonica è molto utile se temporanea e localizzata nel sito di infezione, in quanto l'interferone è molto tossico. Per alcune malattie esiste una terapia interferonica come nel caso dell'epatite C cronica dove si cerca di limitare la replicazione del virus, lo stesso vale pure per alcuni tipi di tumori dato che ha anche un'attività anti-proliferativa. Quando il soggetto viene sottoposto a interferone esso sta male: ha febbre, problemi intestinali ecc.. effetti quindi tossici. L'interferone viene prodotto da molte cellule in risposta a stimoli diversi. Cellule epiteliali e fibroblastiche, in seguito ad infezione virale o solo in presenza di acidi nucleici, producono interferone β; le cellule dendritiche, i Ly B ed i macrofagi, in seguito a riconoscimento di antigeni estranei, come cellule infettate da virus, cellule esogene, batteri ed antigeni non self, producono interferone α; l'interferone γ è invece prodotto da Ly T attivati e da macrofagi in seguito al riconoscimento antigenico e a mitogeni. Il β è quello che ha attività antivirale. Quando un virus infetta una cellula, rilascia il suo genoma che viene captato e riconosciuto da un sistema di proteine di segnalazione le quali portano, tramite l'attivazione di chinasi, all'attivazione di un fattore di trascrizione che migra nel nucleo e attiva la trascrizione del gene dell'interferone β. Anche i toll like receptor possono essere attivati da acidi nucleici non self e possono attivare altre vie di segnalazione come quella di IRF-7, che viene attivato da chinasi specifiche, e produce interferone α che viene rilasciato all'esterno; IFN α è infatti una proteina secretoria. Esso può andare a legarsi, ad esempio, su recettori per l'interferone di cellule limitrofe. Il legame ai recettori attiva una via di trasduzione del segnale che porta all'attivazione di fattori trascrizionali che vanno nel nucleo e attivano almeno 100 geni che hanno una forte attività biologica. Essi possono attuare una risposta antivirale, o nel caso dell'interferone γ, possono attivare cellule del sistema immunitario; possono indurre la produzione di MHC di tipo 1 e 2, e possono anche portare all'inibizione della crescita cellulare (cosa che lo porta ad essere usato nei tumori).

virologiaVediamo cosa succede quando l’IFN si lega ai recettori. Questi recettori sono in dimero e, quando si ha il legame tra IFN di tipo 1 e recettore, si ha la dimerizzazione dei due recettori R1 e R2, questo induce il reclutamento di due chinasi al di sotto del recettore, che sono la jak1 e una tyk2 (tirosin chinasi), che fosforilano fattori trascrizionali citoplasmatici, stat1 e stat2, che dimerizzano e migrano nel nucleo andando a legarsi a sequenze specifiche IRSE (interferone responsive sequence element) insieme alla proteina nucleare p48. Si forma un complesso trimerico che induce la trascrizione di circa 100 geni con funzione essenzialmente antivirale. IFN γ usa recettori diversi che reclutano sempre due chinasi, jak1 e jak2, che fosforilano un solo fattore trascrizionale, stat1, che omodimerizza, va nel nucleo ed attiva geni con sequenze specifiche GAS, che sono geni che regolano la funzionalità delle cellule immunitarie.

 

virologiaGeni attivati da IFN-1.

Vediamo i geni attivati da IFN-1. Esso facilita l'espressione delle MHC favorendo l'attivazione della risposta immunitaria. In cellule umane e murine si induce la proteina MX, che è in grado di bloccare la trascrizione e quindi la replicazione di alcuni virus, come quelli influenzali e parainfluenzali. Poi abbiamo due geni importanti: quello della 2-5 A sintetasi e quello della chinasi detta proteina chinasi R (PKR). Nella cellula legata dall’interferone si producono queste proteine. La PKR viene sintetizzata come singola proteina, ma, in una cellula infetta, questa chinasi, se incontra un RNA a doppio filamento, si attiva. (Esistono virus a doppio filamento di RNA; tutti i virus a RNA replicano con intermedi di replicazione a doppio filamento di RNA; i virus a DNA possono avere in certi fasi di replicazione doppi filamenti di RNA). Questa chinasi quindi, quando incontra un doppio filamento di RNA, dimerizza, si autofosforila e acquisisce attività catalitica mirata alla fosforilazione di una serina detta 51 (particolare che non chiederà all'esame) della subunità α del fattore di traduzione EIF2 che è fondamentale per l'inizio della traduzione in quanto serve per permettere il riciclaggio di GTP necessario per fare il complesso di inizio della traduzione. In una cellula infetta la fosforilazione di questo fattore traduzionale è in grado di inibire la traduzione: si osserva disassemblamento dei polisomi, e la sintesi proteica è inibita sia per la cellula che per il virus. La 2-5 A sintetasi è un altro enzima prodotto a seguito dell'effetto dell'interferone. Essa si attiva sempre quando lega un RNA a doppio filamento. Questo enzima sintetizza strani oligonucleotidi che sono una serie di adenine fosforilate e legate insieme con un legame 2-5, cosa inusuale per la cellula che reagisce attivando una RNasi L (latente) che degrada tutti gli RNA che trova come gli mRNA e gli rRNA. Questa degradazione produce RNA a doppio filamento che di nuovo implementano l'attivazione indotta dall'interferone. Questi due meccanismi visti adesso, insieme all'inibizione eventuale della trascrizione e all'attivazione della risposta immunitaria, determinano lo stato antivirale.

virologiaMolti virus presentano dei meccanismi che tendono a bloccare la risposta mediata da IFN 1, in particolare l'azione del PKR. Ci sono due proteine, prodotte da poxvirus e reovirus, che vanno a legarsi al double strand impedendo l'attivazione di PKR. L’adenovirus produce invece piccoli RNA strani a doppio filamento che vanno a legarsi nel sito della proteina PKR dove si dovrebbe legare il double strand, ma, siccome sono molto particolari, non lo attivano bloccandone l'azione. Il virus polio produce una proteasi, la 3C, che degrada PKR. Il virus influenzale induce nella cellula la trascrizione e la sintesi di una proteina cellulare p58 che inibisce l'attivazione di PKR. Il virus herpes simplex (HSV) produce una proteina che è in grado di revertire la fosforilazione prodotta da PKR sulla subunità α di EIF2, nel senso che convoglia una fosfatasi sulla subunità α, quindi PKR fosforila, ma la fosfatasi convogliata dalla proteina herpetica la defosforila mantenendo sempre il fattore attivo, non inibito. HSV quindi sintetizza una proteina γ tardiva che riesce a convogliare una fosfatasi PP1A sulla  subunità α di EIF2 per cui reverte l'attività di PKR che normalmente fosforila, ma la fosfatasi defosforila, mantenendo quindi attivo il fattore di traduzione così da far proseguire la sintesi proteica. Queste sono strategie attuate dai vari virus per far sì che la sintesi proteica delle cellule prosegua, poiché anche loro ne hanno bisogno per formare le loro proteine.

 

Virologia

 

Terapia antivirale                                                                                              Lezione 9 del 26.11.07

 

Molecole antivirali.

L'uomo ha sempre cercato di controllare le malattie virali. Questo può essere fatto in due modi: o con la terapia antivirale o con l'uso di vaccini. I farmaci antivirali non sono tanti e si cerca di conoscere ed identificare i punti deboli dei virus per fare un farmaco antivirale. Un farmaco, per essere tale, deve essere altamente specifico ed efficace. I virus sono parassiti intracellulari obbligati perché sfruttano al massimo la cellule e infatti molto meccanismi di replicazione virale sono cellulari. Non esistono tanti farmaci perché è difficile identificare il target giusto e specifico solo per il virus in modo che non provochi danni alla cellula ospite. Un farmaco antivirale deve intervenire quando già siamo infettati e quindi quando il virus è già penetrato e sta replicando.

Il farmaco a disposizione più famoso, specifico ed efficace è l'acyclovir che è utile solo per infezione da herpes simplex di tipo 1 e 2 o virus VZV. L'acyclovir é un analogo dell'adenosina in cui è stata eliminata parte del desossiribosio: per questo è una molecola aciclica. Sono stati prodotto altri farmaci come il ganciclovir efficace sul citomegalovirus.

Questi farmaci danno come risultato un blocco della replicazione virale. L'acyclovir è molto efficiente perché è una prodrug ovvero una sostanza che prima di divenire attiva, deve essere modificata da una cellula. L'acyclovir, proprio perché è così modificata, non può essere riconosciuta da una timidina chinasi cellulare che generalmente fosforila una timidina a livello della membrana citoplasmatica così da farla entrare. La timidina cellulare non riesce a riconoscere l'acyclovir come suo substrato e quindi non riesce a fosforilarlo. Una cellula non infetta quindi non può farlo entrare (base della selettività del farmaco) mentre alcuni virus, come l'herpes simplex, codificano per una propria timidina chinasi per assicurarsi che possano sintetizzare il proprio DNA avendo substrato a sufficienza. La timidina chinasi sintetizzata dall'herpes simplex è in grado di riconoscere l'acyclovir e quindi di fosforilarlo a monofosfato. L'acyclovir penetra nella cellula infetta e può essere fosforilata anche dalle altre chinasi cellulari divenendo trifosfata così da potersi inserire in un'elica di DNA crescente come quella virale o quella cellulare. Proprio per la sua struttura, questa molecola non può legarsi ad altri nucleotidi, cosa che blocca la sintesi del DNA. Il blocco della sintesi di DNA cellulare non causa danno ma elimina una cellula infetta che quindi non produce più virioni, così da mitigare l'infezione.

 

Terapia dell'infezione da HIV.

Anche per l'HIV si è cercato di identificare sostanze che potessero mitigare o eliminare l'infezione. La prima molecola costruita è la zeta timidina (AZT) proprio sulla base dell'esperienza dell'acyclovir. Questa è un analogo della deossitimidina che presenta un gruppo azide al posto di un OH. Anche in questo caso, quando viene inserita questa molecola in una catena in crescita di DNA, essa non può essere più allungata. Anche la AZT deve essere fosforilata ma le chinasi cellulari possono tranquillamente fosforilarla. L'unica particolarità è che questi virus si integrano nel DNA cellulare trasformando il loro genoma in una molecola di DNA a doppio filamento. Il bersaglio della AZT è quindi a livello della trascrittasi inversa che produce DNA a partire da RNA. Ci sono comunque dei problemi: c'è bisogno di uso di dosi massicce; esso compete con il poll della timidina cellulare dando effetto tossico anche per le cellule (quindi non ha selettività come l'acyclovir). Sono stati emessi degli inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa (attualmente in uso) che sono molecole diverse che vanno a bloccare la trascrittasi inversa. L'uso di un unico farmaco in una infezione che di fatto può comportare l'integrazione del retrovirus, prevede un'infezione per lungo tempo dato che non è facile eliminare il virus completamente. Le trascrittasi virali sono poco efficienti e possono causare mutazioni che possono andare ad interferire con l'efficacia del farmaco. Se il trattamento con il farmaco è prolungato, il farmaco seleziona dei mutanti virali. Sono stati messi a punto quindi altri farmaci, degli inibitori delle proteasi come Ro31-8959 che riproduce chimicamente la stessa conformazione che assumono gli AA che sono il substrato della proteasi dell'HIV che taglia sempre tra glutammina e tirosina; quindi, se noi mettiamo questo farmaco nella cellula, distogliamo l'azione della proteasi che va cleavare il farmaco invece della proteina che ha sintetizzato l'HIV, che necessita di cleavaggio da parte della proteasi per causare la maturazione del virus. Anche qui possono crearsi dei mutanti e quindi di fatto attualmente la terapia contro questo virus viene fatta con un mix di AZT o inibitori non nucleosidici della trascrittasi inversa, o inibitori di proteasi, così da minimizzare l'insorgenza di mutanti multipli che sarebbe rara. Altri inibitori per le replicazione dell'HIV sono quindi gli inibitori di proteasi. La proteasi virale è essenziale per la maturazione di nuovi virioni e questi inibitori di proteasi mimano il sito di clivaggio della proteasi, che cleava queste molecole e non cleava le proteine dell'HIV, cosa che tende ad inibire la maturazione e la diffusione del virus.

Altri inibitori attualmente in fase di studio sono gli inibitori della penetrazione. Abbiamo due approcci. Il primo è quello di inibire l'adsorbimento del virus tramite l'uso di sostanze in grado di legarsi a corecettori virali, come ccr5 che è il primo corecettore che viene usato dal virus per penetrare nell'ospite (espresso nei macrofagi). Durante le prime fasi di infezione il virus infetta fondamentalmente i macrofagi. La molecola si chiama SCH-C (non è importante saperlo) si lega ad una regione idrofobica del corecettore, rendendo immuni all'infezione del virus HIV, poiché i corecettori sono fondamentali per la penetrazione del virus nelle cellule. I corecettori sono però recettori per le chemochine che sono deputate alla regolazione del sistema immunitario dell’ospite, quindi ci sono degli effetti collaterali dato che viene inibito il corecettore. Tutto questo è in trial clinico, quindi in sperimentazione. Il secondo approccio è quello che usa inibitori della fusione che sono piccoli peptidi di circa 36mer che sono in grado di legarsi alla regione che funge da peptide fusogeno ovvero la gp41: legandosi a questa regione impediscono quei cambi conformazionali che sono indispensabili perché la gp41 medi la fusione dell'involucro virale con la membrana della cellula ospite. Anche questi sono in fase clinica. L'HIV è un virus a RNA, e i virus a RNA durante la loro replicazione accumulano una grande quantità di mutazioni: usare più inibitori contemporaneamente è la terapia che si è riuscita a mettere a punto per inibire la replicazione del virus. Si è visto che il trattamento solo con AZT, che blocca la retrotrascrizione e la formazione di nuovi provirus, nel giro di 1-2 mesi porta ad insorgenza di varianti che sono in grado di fare la retrotrascrizione anche in presenza di AZT. La stessa cosa vale per gli inibitori delle proteasi che, per mutazioni spontanee selezionate, portano a virus mutanti resistenti al farmaco. La pratica corrente è quindi fare un mix di tutte queste varie sostanze chimiche, facendo un trattamento combinato di vari farmaci, che ci permette di usare dosi minori dei singoli farmaci superando problemi di tossicità; inoltre l'uso contemporaneo di più farmaci rende meno probabile l'insorgenza di un virus che presenta contemporaneamente delle mutazioni responsabili della resistenza ai farmaci. Il farmaco quindi seleziona mutazioni spontanee.

Mutazioni diverse possono avere lo stesso effetto. La stessa funzione può quindi essere governata da più pathway e quindi nel caso del virus che ha resistenza all'acyclovir, può essere dovuta a mutazione della timidina chinasi virale (enzima deputato all’iniziale fosforilazione del farmaco) o mutanti della polimerasi che sono incapaci di incorporare il farmaco all'interno del DNA. La sintesi di virus può continuare ed il farmaco risulta quindi inefficace. La comparsa di resistenza può essere limitata solo somministrando farmaci a dosi efficaci.

 

Farmaci contro il virus influenzale.

Un farmaco come l'amantadina inibisce la spoliazione del virus dell'influenza. Il virus dell’influenza è fatto da un genoma a RNA a filamento singolo ma segmentato, avvolto dalla proteina di matrice M e racchiuso in un involucro; inserito nell'involucro abbiamo i peplomeri del virus che sono HA ed NA. All'interno dell’involucro questo virus presenta un’altra proteina, la M2, che forma dei canali per cui, quando il virus è penetrato nella cellula all'interno degli endosomi, permettono l'effettiva acidificazione dell'interno del virione. Si abbassa il pH e gli ioni idrogeno penetrano attraverso questi pori formati da M2 che mediano i cambi conformazionali della proteina HA2 che permette la fusione dell'involucro virale con la membrana dell'endosoma. L'amantadina blocca la formazione di questi canali ionici. Il trattamento con questa sostanza inibisce quindi la spoliazione, e quindi la fuoriuscita dall'endosoma; l’endosoma diventa quindi lisosoma ed il virus viene degradato. La somministrazione deve essere effettuata entro 24-48 ore dall'infezione e deve essere portata avanti per 10 giorni ad alte dosi. Non ha effetto sui virus dell'influenza B (a livello di patologia indistinguibili da quelli A) che hanno canali ionici diversi rispetto ai virus di influenza A (quindi proteine M2 diverse). Come tutti i farmaci determina l’emersione di mutanti virali. Il trattamento ha inoltre effetti tossici per il sistema nervoso centrale.

Vengono più usati nell'uomo dei nuovi farmaci contro il virus influenzale: Relenza e Tamiflu. Questi sono gli unici farmaci disponibili per l'influenza aviaria. Sono entrambi degli analoghi di acido sialico, che è la molecola responsabile del riconoscimento da parte della emoagglutinina del virus influenzale sulla cellula ospite. La presenza in circolo di questi analoghi distoglie l'azione della HA che si lega a questa molecola e non all'acido sialico presente sulle cellule, e quindi non le infetta. L'azione principale antivirale di questi farmaci non è tanto nel bloccare l'adsorbimento, ma nel meccanismo di rilascio in vivo di nuovi virioni, azione svolta dalla neuraminidasi. Questi farmaci sono quindi in grado di inibire la diffusione del virus nell’organismo legandosi al sito attivo della NA; quindi il corpo produce meno virus ed ha più probabilità di svolgere la clearance, cioè di eliminare il virus dal suo interno. La somministrazione deve essere fatta per impedire la diffusione del virus e deve essere fatta in maniera tempestiva se non preventiva. Anche in questo caso c'è l'emergenza di mutanti virali. Questo è stato il primo esempio di costruzione di un farmaco in maniera razionale: si è andato quindi a disegnare un farmaco che potesse interferire con la HA e la NA. Da qui deriva l’importanza della conoscenza dei meccanismi virali per la lotta contro i virus.

 

Altri farmaci.

Altri farmaci noti sono i farmaci WIN, che sono delle molecole abbastanza semplici in grado di legarsi in una regione detta Chemion (si trova sotto i pentameri dei capsidi dei picornavirus) che è la regione dove si legano i recettori dei picornavirus (Icam-> rhinovirus e PVR->poliovirus). Nella stessa regione si legano gli anticorpi neutralizzanti che sono in grado di riconoscere le proteine del capside virale inibendo la penetrazione del virus nella cellula. Queste molecole si legano nello stesso sito ed impediscono il riconoscimento tra recettore del virus e VAP presente nel capside virale. Sono validi solo in vitro ma non in vivo dove non hanno nessuna efficacia, cosa ne preclude l'uso farmaceutico.

Ultima risorsa è la Ribavirina, analoga di un nucleoside che è in grado di essere incorporato e quindi di bloccare l’elongazione di una molecola in un virus a RNA. E’ stata usata per i paramixoviridae in casi in cui è necessario l'intervento. Questo virus, che nell'adulto causa patologia evidenti nell’apparato respiratorio, in un neonato causa infezioni mortali. Essa è stata usata anche per terapie di infezioni croniche di epatite C insieme all'interferone α. E' stata anche usata nelle infezioni della SARS insieme a molecole antinfiammatorie per ridurre l'edema del sistema respiratorio. Essendo un nucleoside anche lui ha effetti tossici e non è comunque molto efficace. Questi sono tutti i farmaci a disposizione: pochi e poco efficaci.

 

Prevenzione delle malattie virali: vaccini antivirali.

I vaccini sono la migliore difesa che possiamo avere contro le infezioni virali. Il vaccino è una forma di virus modificato, di antigeni virali modificati. Esso è in grado di indurre la risposta delle cellule T citotossiche, e quindi una memoria di cellule citotossiche che sono in grado di riconoscere cellule modificate dalla presenza di proteine virali. I Ly T citotossici sono in grado di riconoscere cellule modificate da antigeni virali e distruggerli tramite diversi meccanismi. Un antigene estraneo induce anche una risposta da parte dei Ly B, che attivandosi, diventano plasmacellule e producono anticorpi specifici contro quel determinato antigene riconosciuto. Il vaccino mette in corpo degli antigeni virali specifici in modo da  far montare queste due reazioni. Sia i Ly T che B hanno cellule della memoria che sono in grado di rispondere allo stesso modo o anche meglio quando reincontrano un nuovo virus dello stesso tipo. Se abbiamo la prima infezione (o vaccino) avremo l'innesco della risposta immunitaria; il titolo anticorpale dopo l'infezione diminuisce, ma se l'organismo incontra lo stesso virus, avremo subito una risposta immediata. Mentre nella fase dell'induzione servono circa 7 giorni per far comparire gli anticorpi, in una risposta secondaria non si ha nessun gap e si ha subito il rialzo del titolo anticorpale. L'organismo non ha neanche sintomi patologici. I vaccini quindi inducono una memoria immunologica contro determinati virus.

I vaccini devono essere costituiti da proteine o virus modificato, così da poterli assumere senza incorrere in una patologia. Devono quindi essere sicuri e non devono essere contaminati da altri patogeni che non c'entrano nulla. Devono anche essere di facile somministrazione. Devono essere stabili per la loro conservazione ed avere un costo limitato. Questi vaccini inducono l'immunizzazione che viene detta attiva per distinguerla da quella passiva detta anche sieroprofilassi, ovvero, quando sappiamo che siamo stati infettati da un virus, possiamo anche farci un'iniezione di anticorpi che vanno in circolo e vanno a bloccare il virus. Questi anticorpi hanno però una vita media di pochi giorni e quindi di fatto non siamo protetti da una nuova infezione in  cui potremmo incorrere. La vaccinazione invece conferisce immunizzazione attiva, tramite la creazione di cellule della memoria che sono in grado di reagire subito quando si reincontra lo stesso antigene.

 

Vaccino contro il vaiolo.

Il vaccino più antico è il vaccino contro il vaiolo. Fino agli inizi degli anni 80 il vaiolo in varie parti del mondo era in grado di sfigurare o uccidere circa il 10% della popolazione mondiale. Grazie alla vaccinazione intensiva questo virus è stato eradicato dalla faccia della terra (1979). Il virus esiste solo nei laboratori di ricerca ed è l'agente più sospettato per un bioterrorismo [ormai non ci si vaccina più contro il vaiolo quindi se venisse reintrodotto morirebbero tutti (mentre lo dice la prof ride!!)…la prof è vaccinata e quindi sopravvivrebbe e la ripopolazione della terra sarebbe affidata a lei!!!]. Già nell’11o secolo medici cinesi si erano accorti che prelevando il materiale biologico formatosi dall'epidermide del malato del vaiolo (si formano delle grosse pustole che vanno disgregandosi coinvolgendo tutto il corpo) e strofinandolo sopra l'epidermide di individui sani, si riusciva ad evitare l'infezione o comunque si aveva una forma di infezione meno grave. Questa pratica continuava nei secoli, la pratica della variolazione. Queste pratiche spesso però portavano all'infezione dell'individuo trattato. Per fortuna alla fine del 700, Jenner, medico inglese, si accorse che i bovini incorrevano in una patologia simile a quella umana ma, mentre l'uomo veniva sfigurato e moriva, il bovino non subiva questa sorte in quanto sopravviveva. Questo virus, il poxvirus bovino, derivato dai bovini, si pensava che potesse proteggere l'uomo dal virus umano. Egli fece quindi un esperimento in vivo in un ragazzo introducendogli il materiale prelevato dalle lesioni del bovino. Dopo averlo trattato con questo materiale di derivazione bovina, lo infettò con il virus umano: il ragazzo invece di avere la classica infezione da vaiolo umano, manifestò una lesione limitata e localizzata senza ammalarsi. Da qui deriva il termine di vaccinazione. Il vaccino che ha permesso l'eradicazione del virus è lo stesso che ha identificato Jenner e che viene usato ancora oggi. La lesione che i vaccinati hanno nell'avambraccio è la lesione determinata dal virus bovino.

 

Vaccini antipolio.

Altra vaccinazione è quella antipolio (quasi completamente eradicato), enterovirus che appartiene alla famiglia dei picornavirus. Esso è in grado di fare epidemie primarie e secondarie. Attraverso l'infezione del tratto enterico questo virus raggiunge il circolo ematico ed infetta altri organi come fegato e milza dove si replica abbondantemente; successivamente fa una viremia secondaria che infetta i neuroni determinando la morte dei neuroni e quindi paralisi. La distribuzione di questi virus era mondiale fino al 1961. Nel 1961 iniziano però le vaccinazioni di massa, che cominciano ad avere effetto riducendo i casi di poliomelite in America ed Europa. Si è andato a vaccinare il resto del mondo e, nei nostri giorni, il poliovirus rimane confinato all'India e ad alcune regione dell'Africa. L'ultima epidemia di poliovirus avvenne all'inizio degli anni 50. In America si ebbero 20.000 casi l'anno di paralisi con percentuale di morte del 10%. Alla fine degli anni 50 si fecero dei vaccini. Il primo è quello di Salk. A distanza di 5 anni venne messo a punto il vaccino di Sabin, che prese anche il premio nobel.

Vediamo le differenze tra i due vaccini:

  • Quello di Salk, prodotto nel 1955, è un vaccino inattivato, ovvero il virus viene prodotto in laboratorio, viene purificato tramite ultracentrifugazione, si prende questo virus e lo si sospende in un piccolo volume di tampone e si tratta con sostanze come la formalina che è in grado di fissare l'antigenicità delle proteine: non si distrugge l'antigenicità delle proteine che mantengono il loro potere antigenico anche se il virus viene inattivato. Il vaccino per essere utile deve contenere, oltre al virus inattivato, tutti e tre i sierotipi di poliovirus che si conoscono che indipendentemente possono dare tutti e tre la patologia. La somministrazione avviene per via parenterale (iniezione e quindi una via diversa da quella orale o rettale). Il sistema immunitario, accorgendosi che ci sono antigeni virali, risponde e si ha l'induzione di cellule citotossiche e la presenza di anticorpi che sono fondamentalmente della classe IgG. Per la via di somministrazione questo vaccino non è in grado di indurre la produzione di IgA che si trovano nelle mucose. Questo non permette un blocco immediato a partire dalla bocca, ad esempio. Un soggetto vaccinato con questo non ha malattia ma quando si ingerisce il virus, esso può replicarsi tranquillamente nell'intestino anche se non si ha la paralisi. Nell'intestino esso comunque replica tranquillamente e quindi viene poi secreto attraverso le feci diffondendo nell'ambiente, cosa che quindi può portare ad infezione di altri soggetti non vaccinati (la prof ride!!). Questa vaccinazione prevede un costo elevato dato che necessita anche di un virus. Per avere un livello di IgG alto è prevista una serie di richiami per aumentare il titolo anticorpale ad alti livelli. Questi vaccini sono facili da produrre ma piuttosto costosi e sono molto sicuri (assumendo che l’inattivazione sia completa!).
  • Nel 1961 Sabin mette a punto il nuovo vaccino contro il polio. Esso consiste in un virus attenuato che è un virus replicante che può replicare nel sistema enterico, ma che però non è in grado di dare la patologia; perdendo la neurovirulenza non è quindi in grado di infettare il sistema nervoso. La somministrazione è facile ed avviene per via orale. Si mettono delle goccioline di virus su delle zollette di zucchero. Questa vaccinazione, oltre a indurre anticorpi della classe IgG, essendo un’infezione naturale in quanto il virus va a contatto con le mucose, determina la produzione anche di IgA. La vaccinazione impedisce sia lo sviluppo della malattia, sia la diffusione del virus attraverso la replicazione nel tratto gastrointestinale. Questo quindi non comporta la diffusione del virus. Basta una sola immunizzazione (una sola vaccinazione) per indurre alti titoli di anticorpi.

 

Per fare un virus attenuato basta farlo replicare in sistemi cellulari diversi dal loro ospite naturale, o farlo replicare a temperature diverse da quelle di replicazione. A questo punto si formano dei mutanti, che spesso hanno perso parte delle informazioni che li rendono normalmente patologici. Queste mutazioni sono fondamentalmente raggruppate in due classi: incapacità di riconoscere le cellule bersaglio, oppure incapacità di raggiungere l'organo bersaglio. Entrambe queste classi si hanno nel virus attenuato. Ad esempio, nel caso del poliovirus, si ha una assenza di neurotropismo (non riescono più ad infettare le cellule nervose), e quei pochi che comunque riescono a farlo non si replicano bene quindi non si ha la patologia del sistema nervoso. Quando assumiamo questo vaccino, nulla toglie che abbiamo una patologia enterica che dura 10-15 giorni. Anche il vaccino attenuato deve avere tutti e tre i sierotipi. Il modo per attenuare il virus è passarlo in cellule di ospiti diversi. Il poliovirus è un virus umano, in grado di infettare anche altre cellule. Sabin fece 21 passaggi in vivo iniettando il virus nel cervello di scimmia. Infetta e prende il virus dal cervello per 21 volte. Questo per adattarlo all'ambiente delle cellule di scimmia. Questo virus adattato venne passato per 8 volte in vitro in colture di cellule derivate da cellule di scimmia: questa è una fase di adattamento che permetteva una coltura in vitro, per poter fare replicazione in laboratorio. Una volta ottenuto un virus in grado di replicarsi in queste cellule, Sabin passò per 39 volte questo virus da cellule derivate da rene di scimmia. Fece infine delle purificazioni per placca sempre su cellule di scimmia per avere un unico virione (la placca è un unico virione che si diffonde nelle cellule). Questo virus venne poi passato per altre tre volte in colture di tessuto così da espandere il virus e averne una quantità tale per fare il vaccino.

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Il virus selvatico subisce molte mutazioni durante questi passaggi. Le mutazioni fondamentali per l'attenuazione del virus sono quelle della regione UTR che sono in grado di inibire la traduzione degli RNA e la maturazione del virus, per quanto riguarda le proteine strutturali nel sistema nervoso centrale, impedendo un'efficace replicazione. Quale scegliere tra due vaccini? Venne scelto quello di Sabin nel 1961 in quanto è un'infezione naturale che quindi permette la replicazione nell’organismo vaccinato che induce una risposta immunitaria autentica, ma anche un'amplificazione del virus che rimane però sempre attenuato. Ci si accorse che spesso in una percentuale che si aggira su 1 su un milione di persone vaccinate, si aveva l'induzione di poliomelite dovuta alla vaccinazione. Si è visto che questa poliomelite vaccinale era dovuta alla reversione e quindi ad altre mutazioni che riportavano il virus a wt causando la poliomelite vaccinale. Il virus diventa altamente enterotropico, quindi si replica bene, ed è in grado di andare ad infettare soggetti non immuni. Si è comunque continuato ad usare questo vaccino. Attualmente, per evitare la poliomelite vaccinale, la prima vaccinazione è quella di Salk e poi si fa il vaccino di Sabin.

 

Vaccino contro la rabbia.

virologiaUn altro vaccino messo a punto è quello contro la rabbia. Il virus della rabbia è endemico in molte popolazioni di animali selvatici come procioni, volpi e lupi. Attraverso il morso di questi animali il virus è in grado di legarsi al sistema microtubulare, di andare in senso retrogrado fino a giungere al midollo spinale e migrare nell'encefalo dove si ha la comparsa dei sintomi classici della rabbia come difficoltà di stare alla luce ed idrofobia. Il virus raggiunge l’epidermide della mucosa orale ed è ritrovato nella saliva permettendo l'infezione tramite morsi. Pasteur fece il vaccino contro la rabbia nel 1890. Egli fece un vaccino attenuato dato che alcuni animali non hanno mai la rabbia come i conigli. Egli quindi infettò i conigli e fece vari passaggi di questo virus selvatico. Prese il cervello del coniglio, lo fece a pezzi, lo tritò, facendo poi vari passaggi. Iniettò infine questo materiale in un cane, vedendo che il cane non aveva nessuna patologia. Facendo poi altri esprimenti accertò il suo vaccino antirabbico. Pasteur fu quindi responsabile dalla messa a punto del primo vaccino sperimentale. Attualmente il vaccino antirabbico non è più un virus attenuato. Esistono due tipi di vaccini. Si cerca di vaccinare gli animali domestici in modo che non ricevano il virus rabbico dagli animali selvatici. Attualmente il vaccino che viene fatto negli animali è un vaccino ricombinante. Nell'uomo possiamo usare un vaccino inattivato, virus trattati con formalina (come abbiamo visto prima). Non c'è bisogno di una vaccinazione preventiva a meno che non abbiamo avuto un  morso. In questo caso si effettua quindi la vaccinazione con virus inattivato. E’ l’unico esempio di vaccino utile in post esposizione. Il passaggio dal sito di entrata al sistema nervoso è un passaggio lento e quindi la vaccinazione normalmente è in grado di indurre la produzione di antisepsi prima che il virus raggiunga il sistema nervoso centrale. Si fa anche in centri antirabbici una sieroprofilassi per avere tutti gli anticorpi in circolo.

 

Vaccino antinfluenzale.

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Ogni anno vengono prodotti tanti di questi vaccini tramite uova embrionate. Si inietta il virus e dopo 48 ore l'uovo embrionato produce una quantità elevata di virus; si prelevano quindi i virus dall'uovo e si purificano. Su questo virus purificato possiamo allestire due tipi di vaccini, uno detto intero con virus inattivato, oppure si tratta il virus con detergenti non ionici come saponi che sciolgono i lipidi e che purificano solo le proteine esterne come HA e NA, i così detti vaccini subvirionici. Questo vaccino deve essere somministrato ogni anno. Questi vaccini sono fatti da una miscela di proteine HA e NA derivate da tre ceppi di virus influenzale differente, in particolare si usano due ceppi di influenza A e un ceppo di influenza B. Questi tre ceppi che fanno il vaccino dell'anno in corso sono i virus influenzali che sono circolati di più nell'anno precedente. Vari laboratori nel mondo isolano e caratterizzano i virus influenzali che causano l'epidemia di influenza. Se il ceppo è molto diffuso nel 2007, farà parte del vaccino che verrà dato nell'inverno del 2008. I virus a RNA mutano e quindi si cerca di vaccinare le persone con il virus più vicino, da cui probabilmente è sorto il virus che circolerà l'anno dopo, ma con poche mutazioni. Il vaccino quindi non può essere fisso. La variabilità è dovuta a queste mutazioni. Tutto il virus muta ma quelle che ci interessano da un punto di vista vaccinale sono quelle di NA e HA che sono quelle a cui rispondiamo con il sistema immunitario. Accumulando mutazioni il virus può produrre una HA che non viene più riconosciuta dagli anticorpi. Questo fenomeno di mutazione costante è detto antigenic drift (deriva antigenica) dovuta a tutte le mutazioni che occorrono. Le mutazioni che sono intervenute fino adesso nell'HA e nell’NA sono raggruppate in vari tipi. Abbiamo quindi 15 tipi di HA e 9 tipi di NA. Ogni gruppo di HA comprende tanti tipi di virus, quindi i virus influenzali sono tantissimi. I virus hanno una nomenclatura che possiamo vedere nell’immagine sotto. Il virus influenzale non è solo umano ma appartiene anche ad altri organismi.

 

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Vaccini p2                                                                                                        Lezione 10 del 29.11.07

 

Vaccino antinfluenzale.

Ci siamo lasciati parlando del vaccino antinfluenzale; abbiamo visto perché c’è l’esigenza di rifarlo tutti gli anni: questo perché il virus muta, in quanto la Rna polimerasi Rna dipendente del virus non è in grado di controllare i suoi errori, quindi i virus costantemente accumulano mutazioni. Questo fa sì che ogni anno nel mondo occidentale, durante il periodo invernale, ci siano epidemie influenzali: un po’ di persone rimangono a letto con l’influenza. L’influenza è pericolosa, non solo per le temperature elevate, pericolose per persone sofferenti di cuore ed altro, ma anche perché il danno dell’epitelio respiratorio diventa vittima di infezioni batteriche; infatti spesso, dopo una pesante influenza, il medico consiglia antibiotici, anche se per il virus non servono a niente ma servono da protezione per i patogeni batterici che potrebbero colonizzare e darci problemi. Nonostante siamo abituati a convivere ogni anno con questo virus, l’influenza è ancora una delle principali cause di morte dovute ad infezioni virali nel mondo.

I vaccini sono fondamentalmente due: inattivati o a subunità.

virologiaPuò capitare che ci possono essere degli anni in cui la maggior parte della popolazione sperimenta l’infezione con il virus dell’influenza: in questo caso parliamo di pandemia e non di epidemia per indicare la diffusione del virus. Questo perché il virus influenzale può variare anche per un'altra ragione oltre alle mutazioni. L’accumulo di mutazioni viene chiamato deriva antigenica, o antigenic drift, mentre quando il virus causa pandemie si parla di cambio antigenico maggiore o antigenic shift(cambio repentino).

virologiaLe pandemie più famose a partire dal secolo scorso sono la pandemia spagnola sostenuta dal virus h1n1 (H sta per emoagglutinina, N per neuraminidasi ed 1 per la proteina) nel 1918. Poi abbiamo avuto nel ’57 l'influenza asiatica sostenuta dal virus h2n2 e poi nel 1968 abbiamo avuto la pandemia Hong Kong del virus h3n2. Rispetto ai virus che circolavano nel ‘56 c'è stato qualcosa che ha determinato la comparsa di questo virus nuovo. I virus influenzali sono di tre generi: A, B o C; i virus dell'uomo sono i virus del genere A e B mentre i virus che infettano gli animali sono del genere A e C. Quindi capita che il genere A sia comune tra gli animali e l’uomo.

Gli ospiti del virus influenzale sono quasi tutti i mammiferi ma anche gli uccelli sia domestici che selvatici. La distribuzione rispetto ai vari sottotipi di emoagglutinina e neuraminidasi è riportata in questo grafico dove possiamo osservare che gli uccelli sia selvatici che domestici presentano tutti i tipi di HA e di NA fino ad ora identificati; i vari mammiferi presentano solo alcuni tipi di HA e NA mentre l'uomo è stato invece infettato da virus che hanno soltanto HA e NA particolari (per quanto riguarda HA è solo di tipo 1, 2 e 3 mentre NA è di tipo 1 e 2). Dentro gli h1 poi ci sono anche i sottovirus, delle varianti leggermente diverse ma con determinanti in comune; infatti se ad esempio nel 2006 siamo stati infettati da un h3n2 (virus che circola in questi anni), il virus che ha circolato lo scorso anno moltiplicandosi di ospite in ospite si è leggermente discostato da quello che abbiamo sperimentato, ma senza cambiare il tipo di h ed n. Quindi h3n2 circolerà probabilmente anche quest’anno anche se leggermente diverso da quello dello scorso anno ed è per questo che bisogna fare costantemente il vaccino, per stare dietro ai virus che cambiano e sperimentare un vaccino per l’inverno successivo.

virologiavirologiaQuesti uccelli sono un po' particolari: gli uccelli selvatici e domestici presentano virus aviari propri; c’è il passaggio dal virus aviario all'aviario domestico (la gallina) e questo virus aviario non ha i recettori per l'uomo perché virus aviari e virus umani sono molto diversificati dato che utilizzano recettori diversi: i virus aviari sono in grado di riconoscere come proteine di adsorbimento l'acido sialico legato in posizione 2,3 al galattosio mentre i virus umani riconoscono solo l’acido sialico (quindi acetilglucosammina) legato in posizione 2,6 al galattosio. Il virus aviario non può infettare l’uomo ma può infettare i maiali perché essi hanno sulle loro cellule sia l’acido sialico 2,3 che l’acido sialico 2,6. Quindi il maiale può essere infettato da un virus aviario ma anche da un virus umano e quindi diventa un mix che può creare un nuovo virus completamente differente, detto virus ricombinante, che può eventualmente avere molte proteine del virus aviario ma anche l'emoagglutinina del virus umano così da poter infettare anche l'uomo. Questo virus sarebbe totalmente nuovo per la specie umana e sicuramente causerebbe una grande pandemia; questo è il meccanismo molecolare che può capitare solo con i virus influenzali perché sono gli unici virus, a parte i Reovirus, che hanno il genoma segmentato. Quindi se una cellula è infettata con un virus avrà i colori dei segmenti (acidi nucleici); se questa cellula, ad esempio di maiale, viene infettata da un altro virus che ha il segmento blu e giallo, il virus riassortante tramite il meccanismo di riassorbimento presenterà delle variazioni, come un filamento giallo e un filamento viola. Proprio perché sono virus segmentati e siccome durante il processo di gemmazione i vari segmenti vengono acquisiti con un meccanismo ancora sconosciuto (conoscendolo avrebbe permesso di intervenire biotecnologicamente per evitare questo fenomeno), questo nuovo virus può acquisire nuovi filamenti; l’importante è che gli rimangano 8 filamenti perché il genoma del virus influenzale ha 8 filamenti.

I virus influenzali prendono il nome dal luogo in cui vengono isolati e molte pandemie originano dall’Asia perché in Asia esistono ancora le condizioni per far avvenire questo scambio dato che l'uomo vive molto nelle campagne a contatto con gli animali domestici e di allevamento e può quindi avvenire questo scambio di virus.

La più grande pandemia che c'è stata è quella del ‘18, detta Spagnola che nel giro di 6 mesi ha fatto 50 milioni di morti nel mondo con una percentuale di mortalità del 2,5% (recentemente la Sars invece ha avuto una % di mortalità del 60%, quindi molto più elevata). La culla di questo virus è stata probabilmente la Francia durante la prima guerra mondiale a causa di un grande accampamento militare: per il sostentamento di queste truppe venivano allevati nello stesso accampamento sia maiali che vari tipi di uccelli. Le condizioni igieniche quindi non erano ottime a causa delle convivenza tra animali e uomo. C'era anche la vita da trincea quindi sovraffollamento, guerra e scarsa alimentazione che hanno facilitato la diffusione del virus nell'area francese. Subito dopo c’è stato l'armistizio, quindi le truppe tornano a casa ed il virus si propaga prima in America e poi rapidamente in altre parti del mondo come in Europa. I morti erano soprattutto giovani tra 20-40 anni ed in quegli anni non c’erano gli antibiotici quindi la sovrapposizione con le infezioni batteriche è stata la vera causa di morte. Recentemente a partire del 1977 sta capitando qualcosa di più grave perché ci sono state delle piccole infezioni sostenute da virus diversi; abbiamo visto che i virus umani hanno solo h1, h2, h3 ed n1, n2 ma può esserci la comparsa di casi singoli di infezioni con virus che non hanno mai interessato l'uomo e che sono tutti di derivazione aviaria. In particolare, sempre più spesso sta comparendo il fenotipo h5n1. Sono virus aviari che in qualche modo mutando sono diventati in grado di riconoscere i recettori umani; non c’è stato nessun riassortimento particolare. I virus aviari si possono distinguere in: virus ad alta patogenicità o a bassa patogenicità (la maggior parte); uno aviario ad alta patogenicità è h5n1 che determina la morte degli animali infettati e questa maggiore patogenicità dipende da delle sequenze AA nel sito di cleavaggio della proteasi cellulare che deve cleavare il precursore della emoagglutinina per formare le due proteine ha1 e ha2. Queste variazioni AA causano una maggior efficienza di replicazione e diffusione nell'organismo determinando la morte. Proprio recentemente (circa un mese fa) è stato dimostrato che può esserci il passaggio diretto uccello-uomo e la variante di h5n1, una volta che ha infettato l’uomo, può anche essere trasmesso da uomo ad uomo. Questo è il problema che abbiamo attualmente di fronte con il virus influenzale. Se il virus prende realmente il sopravvento nella popolazione si ha una pandemia simile alla Spagnola, sicuramente con un numero minore di morti ma con una mortalità di circa l'80%. Grazie agli antibiotici non avremmo le sorti del ’18 ma questo è un virus molto più patogeno della Spagnola.

 

Vaccino anti-Epatite B.

virologiaIl vaccino contro l'epatite B impedisce di infettarci con questo virus che può determinare una forma di epatite cronica portando danni rilevanti al fegato come cirrosi ed epatocarcinomi. Il vaccino è recente rispetto agli altri, ha circa 30 anni di vita. Il virus dell’epatite B non può essere coltivato in laboratorio e quindi l’unica strategia è creare in laboratorio la proteina che costituisce la VAP del virus, quindi HbSAg, che spontaneamente si assembla a formare delle particelle simili al virus. E' stato isolato il gene che codifica per questa proteina e fatto produrre da lieviti per fare il vaccino a diversi richiami. Questo vaccino è molto efficace ed ha causato una drastica diminuzione di casi di epatite B a partire dagli anni ’53-’54.

 

Vaccino anti-Papilloma virus.

virologiaE’ l’ultimo vaccino in commercio, il vaccino contro il virus del papilloma umano.

Il virus ha una struttura icosaedrica costituita solo da due proteine, L1 e L2 e all'interno del capside abbiamo un genoma a DNA a doppio filamento circolare che, oltre a codificare le due proteine strutturali L1 e L2, codifica anche per proteine non strutturali come E1, E2, E4, E5, E6 e E7 quindi il virus è abbastanza piccolo. La funzione delle proteine è quella di essere la causa del potenziale oncogenico del virus; E1 serve per la trascrizione del genoma mentre E2 serve, oltre che per la trascrizione anche per la replicazione del DNA virale; E5, a causa del suo legame sulle membrane cellulari, sembra indurre una down regolazione degli antigeni del sistema MHC; E6 è in grado di legare p53 e degradarlo in modo che la cellula non abbia più questo importante fattore di trascrizione che porta la cellula verso l’apoptosi (quindi è una proteina anti-apoptotica), mentre E7 si lega a pRB sequestrandolo e impedendogli di legare il fattore di trascrizione E2F che controlla la replicazione cellulare. Quindi questa proteina induce la replicazione cellulare mentre E6 impedisce l'apoptosi.

Per quanto riguarda il ciclo di replicazione è un virus particolare: tutto quello che si conosce sul virus del papilloma non deriva da studi in vitro perché anche questo, come il virus dell’epatite B, non è coltivabile in laboratorio, quindi si tratta di osservazioni fatte direttamente sui sistemi animali. L'infezione del virus avviene attraverso le mucose o la cute del soggetto che viene infettato. Il virus penetra attraverso un meccanismo di endocitosi ed il DNA rilasciato nel citoplasma penetra nel nucleo della cellula dove si esprime in forma episomale quindi rimane come entità non integrata. Le prime cellule infettate sono quelle dell'epitelio basale: in queste cellule il DNA del virus in forma episomale esprime fondamentalmente proteine precoci come E1, E2 ed E5 e le proteine E6 ed E7. Le cellule seguono la loro linea differenziativa normale ma solo quando la cellula arriva al livello differenziativo dello strato squamoso, il DNA del virus comincia a  replicarsi. Durante questa fase il virus esprime solo le proteine precoci. Mentre le cellule stanno differenziando, la replicazione del DNA comincia e, proprio nella fase terminale dell'epitelio squamoso totalmente differenziato, la replicazione del DNA virale acquisisce un potenziale molto rilevante e vengono anche sintetizzate le proteine tardive, quindi le proteine strutturali L1 ed L2. Il virus viene quindi rilasciato insieme alla desquamazione delle cellule epiteliali. Questo in condizioni normali è il ciclo di questo virus.

virologiaEsistono vari tipi di papilloma umano (circa 100 tipi) che sono differenziati in cutanei o mucosali a seconda della maggior infezione delle mucose o dell’epitelio. I vari papilloma sono classificati con dei numeri. Tutti i cutanei (che sono i tipi 1, 2, 3, 5 ed 8) sono associati allo sviluppo delle verruche, escrescenze sull’epidermide benigne; mentre i mucosali comportano lo sviluppo sia di verruche a livello delle mucose dell'organismo ma anche lo sviluppo di tumori da parte di alcuni specifici tipi come il 16, 18, 31 e 33 che si definiscono ad alto rischio rispetto agli altri che sono a basso rischio. Nel grafico si può vedere il 16 in giallo, il 18 in rosso, il 33 in rosa ed il 31 in blu e sono distribuiti abbastanza uniformemente in tutto il mondo. Il genotipo 16, che è uno di quelli ad alto rischio, è il papilloma umano più distribuito nel mondo con una percentuale del 52% in Asia e del 67% in Africa. Si calcola che circa 300 milioni di donne siano infettate dal virus dell’HPV ma che lo stesso numero coinvolga il sesso maschile dato che l’infezione si trasmette per via sessuale. La fortuna del sesso maschile è che fino ad ora non è stata identificata nessuna patologia con sviluppo di papilloma o verruche a livello dell'organismo maschile, mentre per quanto riguarda le donne queste infezioni sono associate al cancro della cervice uterina. Il 50% del cancro alla cervice uterina è determinato da infezioni di HPV16; il 14% di HPV18 ed un’altra % è determinata da altri tipi di virus ad alto rischio. Adesso che è possibile genotipizzare il papilloma, molte donne vogliono farlo per sapere il tipo di papilloma che le ha colpite, ma questa analisi è abbastanza costosa ed inutile in quanto esiste già un’analisi importante che è il Pap Test, un esame morfologico delle eventuali alterazioni che subiscono le cellule della cervice uterina. La trasformazione da cellula normale a cellula maligna (carcinoma) comporta delle modificazioni che un buon citologo può riconoscere, in quanto si osserva l'aneuploidia con alterazione della cromatina, quindi la cellula si replica e modifica anche il suo volume cellulare con alterazioni morfologiche della cellula evidenti. La causa scatenante di questa trasformazione sono sicuramente le proteine E6 ed E7, anche se da sole non bastano; si è sempre visto in casi di tumore che il DNA virale da episomale diventa integrato. Il fatto scatenante è probabilmente questa capacità, frequente in alcuni tipi come il 16 ed il 18, di perdersi un pezzo di genoma, e questa delezione coinvolge soprattutto le regioni tra E1 ed E2 comportando l’integrazione nel genoma della cellula ospite. In questo modo la cellula che presenta il Dna integrato ha quindi un’espressione costitutiva di E6 ed E7 che aumenta i livelli di queste proteine pro-tumorali al suo interno; recentemente (circa un anno fa) è stato pubblicato un lavoro che ha dimostrato che questo Dna integrato, seguendo i suoi meccanismi di replicazione, è in grado di amplificare il meccanismo di replicazione anche sul Dna limitrofo, quindi sul Dna della cellula ospite. La replicazione di questo virus è complicata perché è circolare, coinvolge forme θ ed è chiamata replicazione a cipolla proprio perché si formano vari anelli negli intermedi di replicazione. Allargare questo meccanismo di replicazione anche ad un Dna cellulare implica che, dato che il Dna cellulare subisce controlli da parte di enzimi di riparo che contribuiscono ad alterazioni del genoma della cellula infettata che presenta Dna integrato, questo comporta lo sviluppo del cancro che, essendo un tumore, ha delle fasi progressive cioè parte da una cellula che si è trasformata e non ha più il controllo.

virologiaMolto spesso questa cellula può non essere sufficiente per determinare il cancro ed è necessaria una progressiva alterazione della cromatina della cellula per sviluppare realmente un cancro; si è visto che c’è in questa progressione verso il carcinoma una grande influenza di fattori ambientali, come il fumo, che determina una maggiore progressione, molto netta, verso lo sviluppo del carcinoma della cervice uterina oltre a colpire il polmone. C’è una tendenza a propagare questo meccanismo di replicazione nel Dna vicino. Questo processo prevede che, dopo l'infezione, l’organismo non riesca ad eliminare il virus e quindi che il virus instauri un’infezione persistente. Questa infezione determina già di per sè delle variazioni a livello delle cellule e tessuti e quindi una progressione differenziativa del tessuto definita Cin1. Nel giro di qualche anno può degenerare e queste cellule all'interno del tessuto assumono una morfologia più neoplastica (Cin2 e Cin3) per arrivare nel giro di 10-20 anni allo sviluppo del tumore.

Si è cercato di trovare vaccini profilattici, quindi vaccini in grado di impedire l'infezione, ma anche antivirali (ne sono stati identificati 4-5 ma senza alcuna rilevanza). Le proteine dei virus hanno una capacità autoassemblante e si è visto che la VAP del virus era L1 e quindi, se si riusciva a fare anticorpi contro L1, probabilmente si poteva impedire l'adsorbimento e l'infezione del virus. L1 è stata purificata e mettendola in soluzione si autoassembla formando delle particelle, ovvero dei capsidi virali vuoti detti Virus Like Particle che assomigliano vagamente ad un capside virale senza genoma. Attualmente sono stati messi in commercio due vaccini: uno solo con L1 con il Virus Like Particle di Hpv16 ed un altro di Hpv16 e 18. La vaccinazione è consigliata per le ragazze intorno ai 14-15 anni. Il virus è molto diffuso, infatti una donna intorno ai 22-25 anni già può aver acquisito il virus del papilloma, quindi il vaccino deve essere fatto in maniera preventiva. Il vaccino viene fatto anche in età più adulta perché ci sono state alcune segnalazioni che indicano che la vaccinazione può essere utile anche nel caso in cui la donna sia già infetta. Comunque se noi ci infettiamo, il virus può essere eliminato dal nostro sistema immunitario; infatti il problema nasce solo quando si ha la persistenza. Il virus si integra a caso anche se ci sono zone cromosomiche più calde ma niente di particolare; perdendo regioni cromosomiche si ha anche la perdita del controllo sulla trascrizione.

 

Insuccessi dei vaccini.

Sono anni che si cerca di sperimentare un vaccino anti-HIV ma senza buoni risultati; lo stesso anche contro un paramyxovirus respiratorio sinciziale: non si riesce a fare un vaccino utile per prevenire queste grosse crisi respiratorie che avvengono nei bambini al di sotto dei tre mesi.

 

 

 

 

 

Nella figura sotto possiamo vedere tutti i vaccini attualmente in uso:

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Vaccini del futuro.

I vaccini del futuro saranno a Dna. Invece di far esprimere le proteine in organismi diversi come i lieviti, possiamo farli esprimere direttamente dall'organismo umano. L'immissione del Dna non è difficile e si può immettere direttamente il Dna in una massa tumorale, quello che codifica per la p53, e si è visto che questa iniezione di Dna ha un effetto terapeutico perché le cellule hanno meccanismi per portarlo all’interno verso il nucleo. Uno dei metodi più facili per far penetrare il materiale genetico è usare vettori virali dato che i virus sono deputati proprio alla penetrazione nelle cellule quindi, se sostituiamo parte del genoma di un virus con Dna terapeutico, otteniamo un successo di trasfezione, di infezione al 100%. Attualmente solo alcuni virus sono stati ingegnerizzati per esprimere proteine estranee come nel caso del vaccino contro il virus della rabbia che consiste in un Poxvirus che è costituito da un Dna molto ampio in cui sono stati eliminati dei geni ed inseriti i geni del virus della rabbia. In questo modo possiamo vaccinare l'animale; le proteine del virus della rabbia si esprimono come proteine vaccino così che l’animale produca gli anticorpi contro il virus della rabbia. Le proteine inserite sono la VAP del virus. Questo determina l’utilizzo di vettori ed i vantaggi sono: l'espressione della proteina ad elevati livelli (perché sta sotto promotori virali che riescono a trascrivere in maniera potente) ed il fatto che possono essere controllate a seconda di dove posizioniamo i geni del genoma del virus; ad esempio se vogliamo far esprimere una proteina del genoma del VSV (a cascata con una trascrizione controllata) dobbiamo metterla vicino all'estremità, intorno alla regione del 3’.

L'uso di virus vegetali è preferibile rispetto all'utilizzo di virus animali; ciò avviene attraverso l'uso di virus vegetali, come il virus della patata con RNA a polarità positiva che infetta ed esprime proteine nella pianta del tabacco. Questo esempio è una sperimentazione che si sta compiendo a Roma all'Enea dove ricercatori cercano di mettere a punto un vaccino terapeutico contro il virus del papilloma umano facendo esprimere, attraverso l’infezione con il virus della patata, le proteine E7 ed eventualmente E6 nel tabacco, così da avere grande quantità di proteine oncogene del virus del papilloma da poter allestire un vaccino terapeutico che interviene quando già l'infezione è in atto. Perché si preferiscono i virus vegetali? I vantaggi sono dovuti al fatto che le piante hanno gli enzimi per portare le stesse modificazioni post-traduzionali, come glicosilazione ecc…per modificare le proteine terapeutiche. Le proteine prodotte nelle piante possono essere accumulate in siti specifici e quindi si ha una grossa concentrazione di proteine non in tutta la pianta ma soltanto in siti specifici come foglie o semi. Le piante non presentano nessun patogeno umano quindi possiamo utilizzarle senza il rischio di infettare l'uomo con un virus che non è stato ancora identificato. Esse forniscono anche un altro elemento fondamentale quando pensiamo ai vaccini, ovvero un basso costo perché possiamo pensare di vaccinare anche l’intera popolazione mondiale. Possiamo pensare di usare questa pianta infettata, che esprime una proteina importante, anche per una terapia umana per via orale eliminando costi notevoli dati dalla purificazione della proteina. In futuro avremo i vaccini edibili, che possiamo mangiare; un ricercatore dell’Università di New York ad esempio ha prodotto una banana che sintezza HbsAg quindi che può essere un futuro vaccino. I problemi interessano solo la quantità di proteina che può essere accumulata nella pianta ma è un problema che si può risolvere abbastanza facilmente. Infettando la patata con il virus della patata in cui un gene è stato sostituito con la proteina L1 possiamo ricreare le Virus Like Particle anche nella patata senza quindi la necessità di iniettare il Virus Like Particle come se fossimo in laboratorio, ma appunto dando da mangiare le patate. Questi Virus Like Particle sono proteine e non virus infettanti; anche se vengono fatte a pezzi comunque vengono riconosciute dal sistema immunitario e quindi si producono anticorpi; è stato sperimentato su donne africane che hanno poi prodotto anticorpi.

 

 

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