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Patologia

 

• Le informazioni qui riportate hanno solo un fine illustrativo: non costituiscono e non provengono da prescrizione né da consiglio medico.

 

Collegamenti utili gratuiti

 

• By StarKeeper ed Alex S.

Patologia

 

Introduzione alla patologia                                                                               Lezione 1 del 12.11.07

 

Libri di testo: libro bello ma pessima iconografia, molto discorsivo; Guido Majno – cellule tessuti e malattie – Fatto apposta con un forte approccio biologico. Altro libro è quello: Pontieri – patologia generale (2 volumi). Altro libro è il Woolf – Patologia generale, meccanismi di malattia – piccolo.

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La patologia generale è lo studio delle malattie e dei meccanismi attraverso i quali queste avvengono. La malattia è un'alterazione dello stato fisiologico dell'organismo capace di ridurre, modificare negativamente o perfino eliminare le normali funzionalità del corpo o della mente, diminuendo le probabilità di sopravvivenza dell'individuo o della specie; la malattia è, quindi, un'alterazione in cui si perde una certa funzionalità. Ci sono stati patologici che dipendono moltissimo dal nostro modo di vivere. Il concetto di normale dipende da intervalli di “normalità”. La malattia può essere intesa anche come stato all'interno del quale la specie è svantaggiata. Potrebbe esserci in qualche maniera perdita della funzione normale, della corretta funzionalità di alcuni organi per fattori esterni ed interni. L'invecchiamento non è una malattia, anche se questa condizione prevede una perdita di funzionalità di alcuni organi. L'essere eterozigoti per l'allele mutato dell'anemia falciforme potrebbe conferire un vantaggio nei confronti della malaria e quindi questa condizione può non essere considerata una malattia.

Il concetto di malattia dipende essenzialmente dal contesto culturale in cui si vive. Per alcune popolazioni africane togliersi i denti è sinonimo di bellezza. I nostri canoni estetici sono soltanto nostri. Il concetto di malattia dipende quindi dal contesto. Tutto questo ci porta ad analizzare il concetto di normalità. Il concetto di normalità è un concetto statistico e non assoluto. I valori di normalità rappresentano quei valori all'interno dei quali l'individuo cerca di adattarsi il più possibile alle stimolazioni dell'ambiente in cui si trova.

Da un concetto puramente statistico di normalità passiamo ad un concetto biologico di adattamento.

Esistono diverse forme di adattamento:

• Esiste una forma di adattamento genetico come nel caso dell'anemia falciforme. Ci sono individui eterozigoti per avere la mutazione a carico dell'emoglobina responsabile della modificazione della molecola stessa. Nel momento in cui la mutazione è eterozigote, l'individuo è in salute e, sebbene potrebbe avere qualche problema dato che non tutti i globuli rossi sono funzionali, l'essere eterozigote può conferire un vantaggio selettivo nei confronti della malaria.
• Esiste poi un adattamento fisiologico in cui, ad esempio, un individuo che permane in alta quota per lunghi periodi di tempo, avrà valori di globuli rossi alterati rispetto al suo standard. Questo avviene perché ad alta quota serve produrre un maggior numero di globuli rossi per sopperire alla carenza di ossigeno.
• E’ presente, inoltre, un adattamento culturale, concetto che deve esserci chiaro in quanto alcuni usi, modi di vita e costumi non sono giusti o sbagliati in se ma soltanto in relazione alla propria cultura. Le popolazioni evolvono secondo la loro storia operando dei nuovi modi di vivere per rispondere alle loro esigenze primarie. Esistono per esempio delle popolazioni nel centro dell’Africa orientale che utilizzano la geofagia ovvero l'abitudine, non frequente, di mangiare ogni tanto piccole quantità di terra, facendolo solo in alcuni posti e non in altri. Questo viene fatto perché magari in quei posti il terreno contiene quella varietà di sali minerali che a loro servono. Questo avviene perché in assenza di acqua non potrebbero facilmente introdurre sali nel loro organismo. E' quindi un sistema naturale per sopperire alla scarsità di acqua del loro territorio.
• Un'altra forma di adattamento è quella inerente la risposta immunitaria che in maniera diversificata risponde a varie situazioni.

 

 

Le malattie possono essere di diversi tipi:

• Si parla di malattia focale quando viene colpita un'area ben distinta di un organo.
• Si parla di malattia diffusa quando essa può colpire parti più estese dello stesso organo, estendendosi.
• Si parla di malattia disseminata quando da un organo può andare a colpire un altro organo.
• Si parla di malattia sistemica quando viene colpito l'intero sistema (es. sistema nervoso in quanto tale e non soltanto le cellule della glia).
• Si parla di malattia generalizzata quando è diffusa in tutto l'organismo.

 

L'eziologia è l'identificazione della causa che porta alla malattia. Per esempio l'eziologia della lebbra è dire che la lebbra ha, come agente eziologico, il Micobatterium Leapre.

Diverso è il concetto di patogenesi.

La patogenesi indica i meccanismi attraverso i quali si innesca una determinata malattia, i meccanismi attraverso i quali si producono le anomalie e le modificazioni del tessuto.

 

I postulati di Koch:

• Il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia.
• Deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura pura.
• Ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano (ma suscettibile alla malattia), si riproduce la malattia.
• Il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente.

 

Vediamo di cosa ci occuperemo in questo corso:

• Ci occuperemo di elementi di patologia cellulare. La cellula è il più semplice paziente vivente e ci occuperemo di patologie di accumulo intracellulare, come l'accumulo di trigliceridi; ci occuperemo di danno cellulare, come quello causato da radicali liberi; infine ci occuperemo delle modalità in cui una cellula può morire, ovvero per oncosi ed apoptosi. (Bisogna tenere bene presente che dal punto di vista della patologia dire che una cellula muore per necrosi è un errore in quanto la morte di una cellula può generare necrosi ma una cellula non muore per necrosi. E' come dire che un paziente è morto per autolisi postmortem. Questo ha a che vedere con il tessuto e non con la causa della morte. E' importante sapere questa differenza. La necrosi non è la causa ma è l’effetto, l'evento finale.
• Ci occuperemo di elementi di immunopatologia che comprendono le immunodeficienze, l'autoimmunità, il rigetto dei trapianti e l'ipersensibilità (ed in questo ambito affronteremo tutti e quattro i tipi di sensibilità).
• Infine ci occuperemo di tumori.

 

Patologia

 

Patologie cellulari da accumulo                                                                       Lezione 2 del 14.11.07

 

Riprendiamo alcune definizioni: Si parla di patogenesi quando ci si riferisce ai meccanismi attraverso i quali si innesca una determinata malattia; si parla di prognosi invece quando ci si riferisce alla previsione del decorso di una determinata malattia; infine si parla di epidemiologia quando ci si riferisce all'incidenza di una determinata malattia all'interno di una popolazione.

L'agente eziologico della gastrite è l'Helicobacter pilori. E' stato visto che questo microrganismo, che è stato isolato dalla mucosa gastrica, è l'agente eziologico perché rispondeva ai postulati di Koch. I postulati di Koch presentano comunque delle limitazioni e non sono sempre validi:

• Alcuni microrganismi non è detto che crescano in terreni microbiologici cosa che impedisce la crescita in coltura pura (secondo postulato)
• Non è detto che inoculando in un animale un certo microrganismo si abbia la malattia perché il patogeno potrebbe essere specifico per una specie e non per un'altra (terzo postulato)
• Possono esserci casi di individui che non si ammalano come i “long terminal survival” nel caso dell'HIV. Questo può essere dovuto a diversi motivi. Alcune persone possono avere un sistema immunitario differente ed in particolare una variabilità a livello delle molecole MHC (polimorfismo) che causano quindi una diversa suscettibilità agli antigeni. Alcuni possono riconoscere l'antigene in maniera più efficiente quando questo è complessato ad alcuni alleli piuttosto che ad altri. Nel corso dell'evoluzione alcuni patogeni si sono evoluti in modo tale che le proprie proteine abbiano pochi epitopi T per alcuni set di alleli che sono quindi meno efficienti nel presentare antigeni. (terzo postulato)

Anche la malnutrizione può influenzare il sistema immunitario a causa della mancata assunzione di alcuni elementi nutritivi fondamentali rispetto ad altri. La malnutrizione deprime la risposta immunitaria rendendo gli individui immunodepressi. Esistono dei patogeni che vengono chiamati opportunistici che determinano malattie importanti in individui immunodeficienti come nel caso dell'AIDS. L'HIV infetta i Ly T cd4, gli individui sono immunodeficienti e sono quindi suscettibili ad infezioni da patogeni opportunisti che normalmente siamo in grado di controllare tranne che in alcune circostanze. La classica infezione nosocomiale od ospedaliera è causata da un patogeno come Pseudomonas aeroginosa che spesso è anche resistente agli antibiotici e che colpisce il sistema immunitario indebolito.

 

Malattie generate da accumuli cellulari

Oggi parliamo di patologia in relazione alla cellula, la patologia cellulare. La cellula, in determinate condizioni, entra in situazioni patologiche dove viene persa od alterata la normale attività metabolica; uno stato di sofferenza che potrebbe anche portare a morte cellulare. La morte cellulare può avvenire a seconda dei casi tramite processi di autolisi o apoptosi.

Una della anomalie più frequenti sono le malattie generate da accumuli in cui alcune cellule cominciano ad accumulare determinate molecole.

 

Accumulo di liquidi.

Affinché una cellula mantenga un equilibrio osmotico vi sono alcuni organelli cellulari che tendono a circoscrivere e racchiudere acqua. Nel nostro caso l'accumulo di liquidi avviene all'interno della cellula. Questo avviene tramite l’uso di pompe ioniche che, utilizzando l’energia concessa dall’idrolisi dell’ATP, trasportano ioni. Se la cellula è però sprovvista di un numero adeguato di molecole di ATP, le pompe non funzionano più, e questo porta all'entrata di sodio all'interno della cellula; l’entrata di sodio genera un gradiente osmotico che porta all'ingresso dell’acqua nella cellula. La cellula si rigonfia e, oltre a poter andare incontro a morte, se il processo è irreversibile, questo rigonfiamento può determinare una pressione presso i vasi sanguigni impedendo la normale circolazione del sangue, rinnovando in questo modo il processo e provocando ischemia. Per ischemia si intende la perdita di nutrienti con il sangue. L’ischemia è una delle più frequenti cause di infarto; in questo processo alcune zone del cuore non sono più irrorate e le cellule del miocardio entrano in uno stato di sofferenza dovuto a mancanza di O2, uno stato di ipossia o anossia che impedisce il proseguimento dei fenomeni di produzione di ATP ossigeno dipendenti e che può portare a necrosi. Le cellule che si rigonfiano, quindi, spingendo sui piccoli vasi, possono dar luogo ad ischemia e di conseguenza a fenomeni di ipossia o anossia e, in casi meno gravi, a fenomeni di ipertensione. Un altro esempio è legato ad alcune condizioni patologiche come quella dei diabetici, caratterizzati da un aumento della concentrazione di glucosio nel sangue; in presenza di un elevato quantitativo ematico di glucosio, alcune cellule possono internalizzarlo e metabolizzarlo, riducendolo in sorbitolo e fruttosio, due molecole osmoticamente attive che tendono quindi a richiamare acqua nella cellula. Questo di nuovo genera un ingrossamento delle cellule endoteliali. I diabetici spesso hanno il fenomeno della retinopatia diabetica, ovvero problemi a carico della vista in quanto i vasi che irrorano la retina sono molto suscettibili ad un incremento ematico di glucosio e possono assorbire e ridurre glucosio richiamando acqua. Questo provoca un ingrossamento delle cellule endoteliali dei vasi, che aumentano di volume fino ad ostruire il normale flusso sanguigno. La retinopatia diabetica può portare anche a cecità, a causa di emorragie del corpo vitreo provenienti dai vasi della retina in proliferazione.

 

Accumulo di lipidi (steatosi).

Un alto tipo di accumulo è quello dei lipidi. Questo stato patologico è chiamato steatosi e si riferisce in particolare all'accumulo di trigliceridi. Le cellule steatotiche sono caratterizzate da una quantità di componenti lipidici superiore al normale. Gli organi maggiormente colpiti sono soprattutto il fegato, la regione corticale del rene, il muscolo e il cuore (vedremo poi che intorno alle cellule morte negli infarti ci sono cellule steatotiche). Questo stato patologico non va confuso con l'obesità, una malattia da accumulo di lipidi negli adipociti.

A livello clinico una delle principali manifestazioni di steatosi consiste in un ingrossamento del fegato; Infatti data la molteplicità delle sue attività metaboliche, la sua particolare vascolarizzazione, e la sua funzione nel ciclo dei trigliceridi e nella sintesi delle lipoproteine, il fegato è l’organo più colpito dalla steatosi.

Le steatosi sono generalmente causate da fattori genetici o esogeni:

Per quanto riguarda le cause genetiche, esse sono legate a mutazioni di geni coinvolti nel metabolismo dei trigliceridi. Ad esempio il morbo di Wolman causa, per un difetto genetico, il malfunzionamento di una lipasi acida che impedisce la metabolizzazione dei trigliceridi; un’altra forma di steatosi geneticamente determinata è la deficienza di β-lipoproteina, una proteina che serve per il trasporto dei trigliceridi all’esterno della cellula. In questa patologia le cellule della mucosa intestinale sono così ricche di trigliceridi da divenire incapaci di assorbirne altri, che quindi restano inalterati nell’intestino e vengono eliminati con le feci (steatorrea).

Le steatosi da cause esogene sono invece tutte derivate da uno squilibrio tra assunzione e metabolizzazione dei lipidi. Se vengono assunti troppi lipidi rispetto a quelli metabolizzati o ne vengono metabolizzati meno di quelli che vengono assunti, essi si accumulano.

Una frequente causa di steatosi dovuta a cause esogene si ha in carenza di ossigeno. Gli acidi grassi devono essere normalmente ossidati ed una carenza di ossigeno non permette la loro ossidazione e quindi ne causa l'accumulo. Lo stato di ipossia può essere generato da alta quota, da ostacoli dell'albero bronchiale, da difetti della membrana alveolare, da alterazioni nel sistema di trasporto dell’ossigeno, dovute ad un insufficiente numero di globuli rossi o ad un difetto dell’emoglobina.

Un altro caso di steatosi è quello che avviene a seguito di infarto. Intorno agli infarti miocardici possono esserci cellule steatotiche. L'infarto è una situazione che deriva da una mancata ossigenazione di una zona del cuore; alcune cellule muoiono e subiscono necrosi, dando luogo all'infarto, mentre altre cellule che si trovano intorno alla zona del miocardio che è andata incontro a necrosi, iniziano ad accumulare trigliceridi, in quanto sono in condizione di ipossia e sono sopravvissute all’infarto con un rifornimento minimo di ossigeno. Questo è un fenomeno comune da un punto di vista anatopatologico.

Un'altra steatosi è quella da sovraccarico. Mangiando molti grassi è chiaro che nei giorni successivi si avrà un grosso accumulo di trigliceridi, soprattutto a carico del fegato. La steatosi così come altre malattie è una malattia reversibile: è possibile ripristinare una condizione normale eliminando le cause esogene che hanno determinato l'accumulo di trigliceridi. Questa patologia spesso dipende da modificazioni dello stile di vita come nella malnutrizione o denutrizione, che cronicizza dando luogo a fenomeni degenerativi che possono portare anche alla cirrosi. La cirrosi indica una distruzione cronica e generalizzata delle cellule epatiche, con relativa perdita della funzionalità epatica. L'obesità invece dipende dall'accumulo di grasso negli adipociti che aumentano di numero e grandezza. Con grassi ci riferiamo non solo ai trigliceridi ma anche al colesterolo ad esempio. Spesso steatosi ed obesità sono associati anche se quest’associazione non è una regola.

Oltre alla steatosi da sovraccarico c'è anche quella che deriva da un'aumentata mobilizzazione dei lipidi dei tessuti adiposi, come nel caso dei diabetici che prendono energia dai trigliceridi e dagli acidi grassi. Nei soggetti diabetici la carenza di insulina induce lipolisi e la lipemia si mantiene elevata.

Un'altra forma di steatosi è quella da carenza di proteine, causata da deficienza di lipoproteine, come la β-lipoproteina, una delle proteine che, negli epatociti, complessandosi ai lipidi è responsabile della loro esportazione. Questa steatosi avviene in individui malnutriti o denutriti. Una dieta molto carente in proteine fa si che i tessuti adiposi vengano mobilizzati così tanto che il plasma diventa lattescente. In questi casi i depositi di grasso negli adipociti vengono richiamati verso il fegato; inoltre si verifica un calo nei livelli di sintesi proteica negli epatociti che blocca la sintesi e l’esportazione delle lipoproteine, con conseguente ritenzione dei composti lipidici.

Questa malattia si può avere ad esempio in ambienti rurali caratterizzati da malnutrizione, in cui il primi nati, quando nascono i secondi, sono costretti ad abbandonare il seno materno, che è la sorgente principale di proteine alla quale possono accedere. La mancanza adeguata di proteine causa quindi il richiamo di trigliceridi, che vengono accumulati nel fegato, il quale non può esportarli a sufficienza per una deficienza nei livelli di sintesi della lipoproteina β. La steatosi viene anche indotta nelle industrie alimentari come nel caso del fois gras in cui le oche vengono fatte diventare steatotiche.

Le situazioni che comportano accumulo di lipidi in alcuni tipi cellulari, ed in particolare nel fegato che è l'organo fondamentale preposto al metabolismo dei trigliceridi, sono sostanzialmente tre:

• Quella che si verifica in seguito all'aumento dei trigliceridi nel sangue.
• Quella che avviene per difetti nei processi ossidativi come nella carenza di ossigeno, in cui gli acidi grassi non vengono ossidati a sufficienza e di conseguenza si accumulano nella cellula.
• Quella che dipende dalla carenza o perdita di funzionalità delle lipoproteine, che sono quelle molecole che negli epatociti si complessano ai trigliceridi affinché questi possano essere secreti nel sangue ed essere immagazzinati negli adipociti.

Un altro caso di malnutrizione è la steatosi da etanolo. L'organo colpito è il fegato, in cui l’etanolo viene metabolizzato. I prodotti metabolici dell’etanolo rilevanti ai fini della steatosi sono NADH e acetaldeide. Lo sbilancio nei livelli di NADH causa un conseguente sbilancio ossidoriduttivo dell'epatocita e può causare un rallentamento del ciclo di krebs; inoltre l’eccesso di acetaldeide, che è un prodotto tossico, inibisce tutte le ossidazioni mitocondriali e quindi l’ossidazione degli acidi grassi, con relativo loro accumulo; l’acetaldeide interferisce, inoltre, con la formazione dei microtubuli, inibendo i processi di secrezione.

Un'ultima forma di steatosi è quella derivante da avvelenamento da tetracloruro di carbonio, presente nel passato quando le condizioni di lavoro erano critiche. Il tetracloruro di carbonio è responsabile della produzione di radicali liberi. La steatosi da tetracloruro di carbonio comporta anch’essa una ridotta esportazione delle lipoproteine dagli epatociti del fegato. I meccanismi che comportano la mancata esportazione delle lipoproteine sono principalmente riduzione dell’attività ossidativa nei mitocondri e blocco della sintesi proteica per il danno da radicali liberi sulle membrane del reticolo endoplasmatico.

Nonostante tutte le steatosi possono essere processi reversibili, nel momento in cui i trigliceridi si accumulano nel tempo, possono dar luogo a fenomeni degenerativi che possono dipendere anche da cause indirette, come la mancata e ridotta ossigenazione di alcune zone di tessuto, dovuto al fatto che queste cellule ingrossate spingono sui vasi e ne impediscono il normale afflusso di sangue all'interno di essi.

 

Danni cellulari da radicali liberi

Dal punto di vista cellulare esiste un tipo di danno che è quello da radicali liberi. I radicali liberi  sono atomi o molecole che hanno un elettrone spaiato nell'orbitale elettronico più esterno; a causa della loro instabilità, questi radicali liberi tendono a reagire molto facilmente portando a gravi danni cellulari.

Nella cellula vengono continuamente prodotti radicali liberi. Nel corso di una risposta protettiva, i fagociti che devono distruggere il microrganismo, lo fagocitano all'interno dei fagolisosomi rilasciando radicali liberi. Il rilascio di radicali liberi non avviene soltanto in seguito alla risposta immunitaria ma anche nel corso di un danno tissutale. Uno dei meccanismi attraverso i quali si generano radicali liberi è la reazione di Haber Weiss(di cui la reazione di Fenton ne è una parte). In questa reazione, in presenza di ferro, viene prodotto un radicale particolarmente reattivo che è il radicale ossidrile (OHO a cui manca un elettrone). Questa reazione è importante nel caso di danni che si verificano nel sistema nervoso centrale. Il rilascio di ferro dall’anello porfirinico presente  nell'emoglobina, può partecipare alla reazione di Haber Weiss, la quale può generare il radicale ossidrile; questo radicale ha effetti tossici e colpisce soprattutto i lipidi, provocando per esempio ossidazione degli acidi grassi, che indebolisce le membrane. Il sistema nervoso centrale è particolarmente suscettibile a questi danni a causa della sua forte organizzazione di membrane. I lipidi di membrana sono infatti tra le molecole più suscettibili all'attacco dei radicali liberi e portano a reazioni di innesco, propagazione e termine.

Si possono formare radicali liberi anche in situazioni di iperossigenazione. Una delle più importanti cause di morte nei primi del 900 si aveva quando ai pazienti veniva fatto respirare ossigeno puro che causa la produzione di radicali liberi e danneggia i tessuti.

 

 

Reazione di Haber Weiss:

1) O2 + Fe3+ à O2- + Fe2+

2) H2O2 + Fe2+ àOHO+ OH- + Fe3+

3) O2- + H2O2 + Fe2+à OHO + OH- + O2

 

Se l'ossigeno è presente in quantitativo elevato, in presenza di Fe3+, può formare anione superossido (O2-) che a sua volta può dar luogo ad altre reazioni. L'anione superossido (O2-), che si produce in seguito a riduzione parziale (un elettrone) di una molecola di ossigeno, può combinarsi con H2O in presenza di ferro e dar luogo all'anione ossidrile (OH- che ha raggiunto l'ottetto) ed al radicale ossidrile (OHO  che manca di un elettrone). La terza reazione è quella di Haber Weiss ed il reattivo OHO  è quello detto di Fenton.

Non bisogna confondere radicale con anione poiché sono cose opposte! Uno manca di un elettrone mente l'altro ne ha uno in più. Il ferro può essere fornito da: ferritina, transferrina, emoglobina e tutte le proteine con gruppo eme. Le molecole bersaglio dei radicali liberi possono essere lipidi, DNA, proteine, carboidrati ecc.. Le molecole attaccate dai radicali liberi possono venire spezzate, distorte o legate l’un l’altra.

 

Come è stato precedentemente detto, i lipidi di membrana sono tra le molecole più suscettibili all'attacco dei radicali liberi, pertanto le membrane plasmatiche sono le strutture più a rischio.

I lipidi formati da acidi grassi polinsaturi (PUFA) hanno doppi legami e possono essere attaccate dai radicali liberi, che possono spezzarli. Nei lipidi in particolare i radicali liberi riescono a distruggere l’organizzazione delle membrane tramite un processo che ha tre fasi: Innesco, propagazione e arresto.

 

 

 

 

• Innesco: i radicali liberi ossidano un acido grasso polinsaturo detto PUFA, in PUFAO, tramite l’estrazione dell’idrogeno e un riarrangiamento dei doppi legami.
• Propagazione: un PUFAO  lega l’ossigeno molecolare (O2) a formare PUFA-OOO.

PUFA-OOO poi reagendo con un altro acido grasso polinsaturo PUFA può formare un altro   radicale PUFAO riducendosi in PUFA-OOH e propagando quindi il danno.

• Arresto: avviene quando si ottengono o dei PUFA-PUFA, tramite una reazione tra due radicali PUFA° oppure dei PUFA-OO-PUFA, tramite la reazione tra due radicali PUFA-OOO.

 

Con queste reazioni viene quindi modificata irreversibilmente l'architettura della membrana.

Il risultato finale di questo processo è, quindi, una lesione molecolare importante a livello delle membrane. I sistemi biologici, nel momento in cui vengono prodotti radicali liberi, sono dotati di molecole, come gli enzimi scavenger, che cercano di tamponare l'effetto tossico dei radicali liberi bloccando queste reazioni. Fra questi abbiamo la vitamina E, un antiossidante presente all'interno delle membrane biologiche, il quale ha il ruolo di partecipare alle reazioni dei radicali liberi ma  impedendone la propagazione. La vitamina E, infatti, reagendo con il radicale PUFA° ne causa la riduzione, impedendo lo svolgersi del processo precedentemente analizzato di modificazione dei lipidi di membrana PUFA, ad opera dei radicali liberi. Riducendo PUFA, la vitamina E si ossida in EO e, a sua volta, il radicale della vitamina strappa l'elettrone dal GSH producendo radicale GSO. Due radicali GSO reagiscono tra loro determinando la formazione di un GSSG. Il GSSG, in presenza di NADPH e glutatione reduttasi, può formare due glutationi ridotti acquisendo un elettrone dal NADPH, il quale viene convertito in NADP+.

Danno da riperfusione.

Le malattie da radicali liberi possono essere causate oltre che dall'esposizione polmonare a ossigeno puro anche da un danno da riperfusione. Nel corso di un infarto del miocardio si assiste ad un processo di ischemia, in cui una determinata regione del miocardio non viene più irrorata dal sangue, causando ipossia e morte delle cellule che si trovano al suo interno. Quando la circolazione viene ripristinata si verifica però un danno da riperfusione, che aumenta il danno cardiaco. In seguito al processo ischemico, le cellule tentano di far fonte al loro fabbisogno energetico partendo da molecole di ATP, che poi diventano ADP e AMP fino ad arrivare all'ipoxantina, che è il prodotto finale della degradazione dell'ATP (un metabolismo generato dal fatto che le cellule sono in una situazione di assenza di ossigeno e c'è quindi la necessità di produrre energia attraverso un meccanismo anaerobico). L’ipoxantina normalmente è bersaglio dell’enzima ipoxantina reduttasi, ma quando però c’è mancanza di ossigeno, quindi una situazione di stress per la cellula, c’è il corrispettivo ossidante, l’ipoxantina ossidasi. La presenza contemporanea di ipoxantina ossidasi, ipoxantina ed ossigeno (che torna dalla circolazione per riperfusione) da luogo alla formazione di H2O2 ed anione superossido O2-, che, in presenza di ferro, da luogo alla formazione del radicale idrossile OHO (reattivo di Fenton). Questo è un importante processo di propagazione del danno che si ha in seguito ad un infarto. Le lesioni che si hanno in un infarto sono generalmente limitate ma si aggravano nel momento in cui si verifica riperfusione dell'organo tramite questo meccanismo. Questo danno da riperfusione è inevitabile nel post-infarto ed è il motivo della prognosi minima di 24h dopo l’avvenuto infarto. Queste circostanze possono portare quindi a sofferenza o morte cellulare.

I radicali liberi possono, inoltre, essere coinvolti nell’oncogenesi attraverso un danno che viene esercitato sul DNA; infine come è stato precedentemente detto, sono generati anche da sostanze quali il tetracloruro di carbonio, o anche da antibiotici.

 

Patologia

 

Morte cellulare e danni tissutali                                                                       Lezione 3 del 19.11.07

 

Oggi ci occuperemo di morte cellulare e di infiammazione, ed in particolare del processo di riparazione che avviene in seguito all'infiammazione.

Per quanto riguarda la morte cellulare sappiamo che ve ne sono due tipi diversi: la morte cellulare accidentale e la morte cellulare programmata; di quest'ultima possiamo avere quella per apoptosi e quella per autofagia. Una cosa importante è che non bisogna confondere morte cellulare accidentale con necrosi, di cui la prima è la causa e la seconda l'effetto.

La morte cellulare accidentale è una morte cellulare che causa un danno cellulare alla cellula. Un tipo particolare di morte cellulare è l'oncosi che può avvenire in seguito ad un processo ischemico. Un processo ischemico è quel processo che impedisce una corretta circolazione sanguigna nel tessuto portando le cellule a mancanza di nutrienti. Associato all'ischemia abbiamo uno stato di ipossia o di anossia. Questo tipo di morte cellulare è associata ad un rigonfiamento della cellula che è diverso dai rigonfiamenti di cui abbiamo parlato la volta scorsa. In questo caso abbiamo un danno diretto della cellula che impedisce il corretto funzionamento delle pompe ioniche di membrana. Le pompe ioniche funzionano con consumo di ATP e, quindi, quando cominciano a scarseggiare le riserve di ATP, esse non funzionano più bene.

 

Morte cellulare “per necrosi”

Nell'ambito della morte cellulare possiamo avere dal punto di vista istologico un quadro diverso. Possiamo parlare di necrosi coagulativa e necrosi colliquativa.

• La prima corrisponde a cellule all'interno delle quali le proteine vengono solo denaturate invece di venire degradate da proteasi, come avviene invece nella  necrosi colliquativa. La denaturazione è un meccanismo importante ed in genere nella maggior parte dei casi la necrosi coagulativa è quella che predomina rispetto alla seconda necrosi che rappresenta un quadro più grave. La denaturazione che avviene per necrosi coagulativa inattiva sia le proteasi che i substrati.
• Nella necrosi colliquativa invece abbiamo una degradazione mediata da proteasi fino a quando i substrati finiscono. Il quadro immunopatologico si aggrava anche perché, mentre nella coagulativa le proteine denaturate tendono ad aggregarsi e  precipitare, nella necrosi colliquativa i peptidi che si formano hanno una forte attività infiammatoria e, andando in circolo, possono formare anche autoantigeni per possibili risposte autoimmunitarie.

 

In questo tipo di morte cellulare non parliamo di morte meccanica ma di una morte relativa ad un problema metabolico in cui le cellule vengono private delle riserve di energia che producono una cascata di eventi. E' difficile stabilire il punto di non ritorno, il momento in cui possiamo considerare una cellula morta per certo oppure no. La ricerca ancora non ha dato risposte a tal riguardo. In mancanza di riserve di energia, a causa della mancata sintesi di ATP che avviene nei mitocondri, le pompe ioniche di membrana cessano di funzionare e comincia ad entrare sodio ed acqua, la cellula si rigonfia, la membrana si distende e la cellula tenta di recuperare quel po' di riserve energetiche avviando la glicolisi anaerobica che, essendo anerobica (in quanto la cellula è in ipossia o anossia) può garantire la sopravvivenza solo per breve tempo. In tutto questo il pH scende in quanto si accumula acido lattico (per la glicolisi anaerobica); questo pH basso sembra essere responsabile della denaturazione delle proteine. La cellula tenta quindi di impedire che le proteine vengano denaturate usando altre proteine che sono le chaperonine, come le heat shock protein, che cercano di mantenere il folding delle proteine, un tentativo che comunque non ha grandi effetti se il fenomeno continua nel tempo; quindi si denaturano sia gli enzimi che i loro substrati.

All'inizio, tra le due necrosi c'è una sorta di equilibrio in quanto, quando le proteasi vengono liberate a pH acido, esse svolgono la loro funzione, ma, quando il pH scende oltre una certa misura, anche le proteasi cominciano a denaturarsi. Nella necrosi coagulativa prevale quindi la componente di denaturazione delle proteine cosa che porta ad un tessuto di colore più opaco e biancastro.

Nella necrosi colliquativa, invece, l'azione delle proteasi è stata molto forte e prevale il secondo evento finale, ovvero la degradazione di tutte le proteine. La cosa importante è il ruolo del calcio che entra a seguito dell'inibizione delle pompe calcio dipendenti che regolano il metabolismo della cellula attivando alcune fosfolipasi che possono ulteriormente danneggiare le membrana ed attivare proteasi, che danneggiano il citoscheletro e le proteine citoplasmatiche, ed endonucleasi che tagliano gli acidi nucleici. La membrana cellulare danneggiata rilascia quindi all'esterno il materiale intracellulare dando l'effetto di necrosi. La necrosi riguarda il tessuto e non è una causa ma solo un effetto!

 

Morte cellulare per apoptosi

Mentre prima abbiamo visto gli eventi di morte che prescindono la volontà della cellula, in questo caso abbiamo una risposta della cellula che innesca un programma di morte cellulare dove vengono attivati specifici enzimi. Questa è una forma di suicidio cellulare in quanto è una scelta che la cellula compie e che si verifica sia in processi normali che patologici. I processi in questione sono ad esempio quelli che avvengono durante l'embriogenesi, la crescita, l'atrofia, il danno tossico, i tumori o nel corso di infezioni in cui il ruolo dell'apoptosi è controverso in quanto alcuni patogeni attivano l'apoptosi per eludere la risposta immunitaria mentre altri patogeni evitano di indurla in quanto morirebbero.

Dal punto di vista morfologico la cellula si riduce di volume, il suo citoplasma diventa denso, la cromatina si addensa lungo le pareti nucleari e il DNA si frammenta in oligonucleotidi, il nucleo si frammenta (carioressi) e la cellula emette protrusioni che con il tempo si staccano formando i corpi apoptotici. Oltre alle differenze viste, l'apoptosi tende ad essere un fenomeno immunologicamente silente e quindi in teoria dovrebbe essere un processo non infiammatorio, cosa che non accade negli altri casi di morte cellulare visti prima. I corpi apoptotici che protrudono vengono immediatamente fagocitati dalle cellule vicine; l'apoptosi non termina infatti con la formazione dei corpi apoptotici ma termina con la fagocitosi dei corpi apoptotici stessi. La fagocitosi è fondamentale per il mantenimento dell'integrità tissutale altrimenti il corpo apoptotico andrebbe in contro a necrosi secondaria. In condizioni normali l'apoptosi dovrebbe avere un significato antinfiammatorio ma questo non è sempre vero. Nel corso di infezione, l'apoptosi può essere scatenata nel momento in cui un fagocita ritiene di non essere in grado di fronteggiare quel patogeno perché troppo numeroso. Esso cerca quindi di fagocitarlo e si suicida inviando, contestualmente all'apoptosi, anche citochine infiammatorie. Questo è un tipico meccanismo innato di difesa dell'ospite.

 

 

 

 

 

 

 

Danno tissutale

Un danno tissutale può generarsi o dall'azione diretta di agenti estranei o dall'azione indiretta dovuta a risposte esagerate, come nel caso di una risposta immunitaria esagerata, ad esempio. In tutte queste circostanze abbiamo un danno tissutale. Nel momento in cui l'ospite si trova a riparare un danno subito, il tipo di riparazione è diverso in base al danno. Nel corso di una infiammazione acuta, se lo stimolo è stato poco intenso e circoscritto nel tempo e, se il tessuto colpito è un tessuto con forte capacità rigenerativa, possiamo avere un processo di rigenerazione in cui il tessuto non mantiene memoria istologica del danno subito. Nel caso in cui lo stimolo è più intenso, dura nel tempo e le cellule sono caratterizzate da una minore capacità rigenerativa o da una incapacità di rigenerarsi, avremo un processo di guarigione detto di riparazione con formazione di una cicatrice. Quando parliamo di tessuti caratterizzati da avere una minore o maggiore capacità rigenerativa intendiamo ad esempio che il sistema nervoso ha assenza di rigenerazione mentre invece un esempio di tessuto con forte rigenerazione è quello epatico come anche soprattutto il tessuto  epiteliale. Nel caso in cui il nostro sistema è caratterizzato da una forte capacità di rigenerazione allora avremo la restitutio ad integrum. Nel caso in cui invece il tessuto colpito è caratterizzato da cellule perenni che non proliferano, in quel caso si perde la funzione di quella parte di tessuto ed avremo reintegrazione connettivale in cui le cellule che non possono più rigenerare si reintegrano con il tessuto connettivo.

A seconda dei tessuti coinvolti avremo diversi tipi cellulari caratteristici ma in tutti questi processi abbiamo delle cellule che troviamo sempre e sono le cellule epiteliali, i fibroblasti, le piastrine, i macrofagi ed i linfociti.

Se abbiamo quindi un danno tissutale, viene attivata subito la cascata coagulativa a cui segue il processo infiammatorio con formazione di essudato; la risposta immunitaria viene attivata e si ha infine l'angiogenesi con la formazione di nuovi vasi, sia che questo porti alla restitutio ad integrum che alla reintegrazione connettivale.

Vediamo un esempio: cosa accede nel corso di una ferita epidermica? Possiamo avere due tipi di ferite: quelle in cui i lembi della pelle possono giustapporsi, come nel caso di un'incisione chirurgica, oppure una ferita lacero-contusa dove abbiamo perdita di tessuto. Nel primo caso avviene un processo di riparazione detto processo di riparazione per prima intenzione mentre nel secondo caso abbiamo il processo di riparazione per seconda intenzione. I due tipi in realtà sono simili con la differenza che nella riparazione di seconda intenzione abbiamo il coinvolgimento di un tipo cellulare diverso non presente nel primo, ovvero sono presenti i miofibroblasti.

 

 

 

 

 

Processo di riparazione di prima intenzione.

Nel momento in cui c'è stato danno tissutale possiamo caratterizzare una sequenza di eventi che avvengono nel tempo. Nel giro di pochi minuti si verifica la formazione del coagulo e poi la formazione dell'essudato che all'aria aperta si secca e forma la crosta, detta escara; si ha successivamente il deposito di fibrina che deriva dal fibrinogeno che si attiva a seguito dell'azione dell'enzima trombina per la cascata coagulativa; abbiamo quindi la produzione di fibrina e fibronectina. Queste due molecole, oltre ad impedire la fuoriuscita di sangue, rappresentano un sistema di sostegno sul quale le cellule che stanno migrando possono muoversi verso la zona danneggiata. Dopo di che comincia il processo di migrazione e proliferazione delle cellule epiteliali che sono state escisse. Nel momento in cui abbiamo perdita di contatto cellulare, le cellula cominciano a muoversi riavvicinandosi tra di loro e creando un fronte che si muove. Questo può avvenire attraverso diversi tipi di movimento. Quale che sia il meccanismo attraverso il quale gli epiteli formano uno strato di continuità, gli epiteli comunque tendono a riavvicinarsi lasciando a questo punto il sottostante tessuto danneggiato con il deposito di fibrine e fibronectine. Nel giro di 24-48 ore abbiamo il risaldamento dello strato epiteliale superficiale e comincia anche la migrazione dei leucociti nella parte sottostante. Deve iniziare a questo punto la digestione del coagulo, che rappresenta una matrice su cui muoversi ma che deve anche essere retratto per permettere la rigenerazione tissutale. Il sistema immunitario si cautela e quindi in ogni caso vengono reclutati macrofagi e neutrofili, che sono le cellule coinvolte sia nella sorveglianza che nel processo digestivo. Abbiamo quindi nel giro di 2-7 giorni l'angiogenesi (neovascolarizzazione) che può avvenire perché alcune cellule come macrofagi e fibroblasti, in situazioni di ipossia, come generalmente si ha nel danno tissutale, cominciano a produrre VEGF (vascolar endotelial growth factor) che favorisce l'angiogenesi. Avremo quindi angiogenesi e proliferazione di fibroblasti che cominciano a produrre fibre di collagene. Il processo di angiogenesi avviene perché le cellule endoteliali stimolate da VEGF cominciano a proliferare e ad incunearsi nel tessuto producendo delle proteasi di matrice che servono per farsi strada in esso. Da un iniziale bottone di cellule, si ha la cavitazione delle stesse e la formazione del nuovo vaso. Si forma quindi una ricca rete di diversi vasi che si collegano tra loro. Sulle pareti di questi vasi vanno ad aderire fibroblasti e macrofagi che producono FGF (fattore di crescita dei fibroblasti) ed i fibroblasti proliferano per dare la reintegrazione connettivale prodotta dal fibricollagene prodotto dai fibroblasti. Essi depositano quindi fibre di collagene fino a che la maggior parte di esse muore per apoptosi ed il sistema vascolare si ritrae. Le cicatrici infatti all'inizio sono rosa e poi piano piano sbiancano. La cute cicatrizzata tende ad essere più bianca in quanto se siamo scuri di carnagione, i melanociti non si rigenerano. Il tessuto di granulazione vascolare si ritrae quindi nel tempo; si ritrae lasciando lo spazio alla fibre di collagene (di diversi tipi) così da formare legami crociati tra le fibre. Questo processo finale di maturazione della cicatrice in cui le fibre prendono contatto e si intrecciano può durare molto tempo, da un paio di mesi ad un anno. Durante questo processo finale scompare anche l'infiltrato leucocitario e fibroblastico, e si forma quindi la cicatrice che sarebbe il deposito di fibre di collagene al di sotto della ferita. Per far si che quel tessuto abbia una forza tensile maggiore è necessario che le fibre di collagene si intreccino, cosa che richiede tempo. I fattori che possono interferire con un processo di riparazione sono le infezioni ovvero quei processi che tendono a mantenere nel tempo lo stato infiammatorio, come anche altri tipi di situazioni patologiche che hanno lo stesso effetto. Ad esempio nel diabete abbiamo visto come l'aumento degli zuccheri del sangue poteva comportare l'accumulo di zuccheri osmoticamente attivi nelle cellule endoteliali richiamando acqua e portando ad una minore circolazione in quei vasi, cosa che contrasta con il processo angiogenetico. Anche i farmaci antiblastici bloccano la riparazione. I farmaci antiblastici sono quei farmaci in grado di inibire la crescita cellulare, e sono utilizzati per esempio nei tumori.

 

Processo di riparazione per seconda intenzione.

Questo tipo di danno si ha nel caso di ferite lacero-contuse. Le fasi iniziali sono molto simili al processo di riparazione per prima intenzione. Si ha infatti la formazione dell'escaria, l'attivazione delle piastrine che producono PDGF, che è un importante attivatore di macrofagi e fibroblasti, si ha la formazione del coagulo, il reclutamento dei leucociti, il processo angiogenetico, il reclutamento e la proliferazione dei fibroblasti, si verifica il deposito di fibrocollagene e, a questo punto, entra in gioco un altro tipo cellulare che prende il posto dei fibroblasti, i miofibroblasti che si mettono trasversalmente alla zona del danno e sono caratterizzati dall'avere fibrille all'interno della cellula (filamenti di actina) che prendono contatto tramite gap junction con le altre cellule così che contraendosi insieme, tendono a contrarre il diametro della nostra ferita. Questo meccanismo è particolarmente importante perché può generare problemi come nel caso dei grandi ustionati (di terzo tipo) in cui abbiamo una contrazione della pelle che può generare deficit motorio.

Un altro esempio di danni tissutali che portano ad una riparazione per seconda intenzione sono quelli causati dall'ulcera del Buruli che è una malattia causata da un micobatterio detto micobatterium ulcerans. Questo è la terza causa di mortalità da infezioni di tipo micobatterico. La prima è quella derivata dal micobatterio della tubercolosi, la seconda è quella del micobatterium leprae che provoca la lebbra, e la terza è quella causata dal micobatterium ulcerans; quest’ultimo genera delle ulcerazioni della pelle, delle zone di necrosi dove si ha perdita di materiale cellulare, con reazioni che possono essere anche molto estese. Queste lacerazioni e perdite tissutali almeno non generano dolore in quanto questo micobatterio produce una tossina detta micolattone che paradossalmente ha un'attività antiinfiammatoria e, quindi, nonostante abbiamo una necrosi di questa portata, non abbiamo infiltrati cellulari. Generalmente abbiamo dolore quando abbiamo un rigonfiamento che stimola la terminazione nervosa ma, se la terminazione nervosa degenera, non c’è dolore. In questa necrosi vengono colpite tutte le cellule ma senza infiammazione quindi senza reclutamento di cellule del sistema immunitario. Questo patologia è motivo di invalidità in quanto si verifica retrazione del tessuto, che impedisce i movimenti. La cute si retrae e questi miofibroblasti cercano di diminuire il più possibile le zone di perdita del tessuto, causando la contrazione dell'arto. Questo può rappresentare ragione di deficit motori importanti. Inoltre queste ferite non sono maleodoranti, sempre perché non c’è una risposta infiammatoria.

Quindi, per ricapitolare: se la perdita di tessuto è stata minimale, non avviene ritrazione ma, se la perdita si tessuto è stata consistente, possiamo avere ritrazione del tessuto come abbiamo visto prima.

 

Molecole coinvolte durante la riparazione.

Abbiamo diverse molecole prodotte e coinvolte nel processo di riparazione. Trattandosi di una risposta che coinvolge la riparazione in seguito ad infiammazione, avremo le varie citochine del sistema immunitario che attivano a loro volta un'ulteriore produzione di citochine proinfiammatorie. Il PDGF viene prodotto prevalentemente da piastrine attivate, macrofagi e cellule endoteliali. Esso agisce soprattutto sui leucociti, i macrofagi ed i neutrofili, aumentando la chemiotassi e la proliferazione dei fibroblasti. L'FGF viene prodotta da cellule epiteliali, leucociti e fibroblasti ed ha un effetto di proliferazione e chemiotassi su cheratinociti, leucociti e cellule epiteliali. VEGF è una citochina che favorisce chemiotassi, proliferazione e produzione di proteasi da parte di cellule endoteliali per favore l'angiogenesi.

 

 

Fibrinolisi.

Come avviene la fibrinolisi? Per far avvenire la formazione del tessuto vascolare è importante rimuovere i depositi di fibrina, cosa che avviene attraverso l'azione sequenziale di un enzima detto attivatore del plasminogeno che lo attiva convertendolo in plasmina. Il plasminogeno ed il suo attivatore sono proteine plasmatiche. Quando il plasminogeno viene convertito in plasmina, questo ha attività fibrinolitica. Nel momento in cui l'attivatore del plasminogeno prende contatto con la rete di fibrina prodotta nella zona di danno, l'attivatore di plasminogeno si attiva e prende contatto con il plasminogeno convertendolo in plasmina, che sarebbe l'enzima attivo dotato di attività fibrinolitica. In tutti questi processi un ruolo importante è svolto dalla matrice extracellulare. In condizioni normali nel tessuto è presente laminina che viene sostituita dalla fibronectina prodotta da fibroblasti, leucociti e cellule endoteliali. Successivamente al processo fibrinolitico vengono depositate fibre di collagene che fungono da struttura di sostegno. Il tessuto cicatriziale non è elastico in quanto manca di elastina, che viene persa nel processo del danno senza venire riprodotta. Sono presenti soltanto depositi di fibre di collagene ma non di elastina, cosa che determina la perdita di distensione. Poi ci sono i proteoglicani, che connettono le diverse componenti della matrice favorendo inoltre la biodisponibilità dei fattori di crescita (FGF, VEGF, HGF-SF), che possono prendere contatto con i loro recettori attraverso ponti di proteoglicani.

 

Tipi di ferite e loro rigenerazione.

Possiamo avere diversi tipi di ferite oltre a quella in cui i lembi si giustappongono. Nel primo caso dell'immagine se la ferita è quadrata, rettangolare o triangolare, la cicatrice risultante sarà nel primo caso una X, nel secondo caso due Y collegate, e nel terzo una sola Y, questo perché il fronte delle cellule epiteliali che migrano fanno si che esse si dirigano perpendicolarmente rispetto al fronte fino a fermarsi quando incontrano i lembi. Nel caso invece di una ferita circolare, i cheratinociti migrano perpendicolarmente alla superficie del fronte fino a quando non possono più proseguire. Le cicatrici circolari tendono quindi ad ovalizzarsi e ad assumere una forma lineare. I chirurghi, per favorire la cicatrizzazione di un taglio circolare, operano delle escissioni in modo tale da “far allungare la ferita” così da far giustapporre i lembi più facilmente.

Uno dei problemi che possono insorgere in seguito al processo di riparazione delle ferite sono i cheloidi in cui alcuni individui, con una certa predisposizione genetica, producono più collagene del necessario formando dei cordoncini che fanno si che la cicatrice si innalzi rispetto alla superficie della cute. Questo non è altro che un deposito esagerato di fibre di collagene che avviene a livello del processo di riparazione di un danno in maniera eccessiva rispetto al normale.

 

 

 

 

Patologia

 

Ipersensibilità                                                                                                    Lezione 4 del 21.11.07

 

Le reazioni di ipersensibilità sono caratterizzate da una massiccia risposta immune. Esistono diverse tipologie di reazioni di ipersensibilità, anche se molte patologie possono assumere caratteristiche intermedie tra questi tipi di classificazioni.

Le tipologie di reazioni di ipersensibilità possono essere classificate in 4 tipi, attraverso una classificazione operata sulla base del tempo: Il primo tipo è un’ipersensibilità immediata, che si sviluppa nel giro di minuti od ore dall'esposizione ad un determinato antigene. Il secondo e terzo tipo sono definiti come ipersensibilità intermedia, in quanto queste risposte possono svilupparsi e risolversi nell'arco di 24 ore. L'ultima tipologia è la risposta ritardata, e compare all'incirca dopo 48 ore. I primi tre tipi sono prevalentemente mediati da anticorpi mentre il quarto tipo è prevalentemente cellulo-mediato.

 

 

La tabella qui sopra mostra le principali manifestazioni patologiche associate a ciascun tipo di reazione di ipersensibilità e i meccanismi effettori di ciascun tipo di risposta.

L’ipersensibilità di tipo uno prevede come meccanismo effettore la produzione di un particolare tipo di Ig, ovvero le IgE, ed è presente un’attivazione mastocitaria, la quale dipende proprio da un meccanismo IgE mediato. Le manifestazioni patologiche relative al primo tipo sono semplici e riguardano principalmente allergie.

L’ipersensibilità di tipo due è mediata da anticorpi IgM o IgG, ed è un meccanismo associato a citotossicità. Il meccanismo effettore finale è un meccanismo all’interno del quale si svolge una risposta citotossica verso una cellula che espone un determinato antigene. Questo meccanismo può essere attivato, o mediante il complemento, o tramite una risposta di tipo ADCC (antibody dependent cellular citotoxicity), mediata dalle cellule NK, le quali, legandosi attraverso il recettore Fc delle IgG, si attivano e riversano i loro granuli citotossici all'esterno. Nella risposta di tipo due si possono avere reazioni a farmaci; infatti alcuni farmaci possono modificare alcune molecole ed antigeni dell’organismo, in modo tale da farle considerare non self, inducendo in questo modo una risposta citotossica.

L’ipersensibilità di tipo tre è quella da immunocomplessi. In questa forma di ipersensibilità accade che una forte presenza di antigeni, a livello locale o a livello sistemico, può provocare la formazione di una quantità di immunocomplessi, formati da antigeni e da anticorpi IgM o IgG, tale da non riuscire ad essere endocitata (gli immunocomplessi in genere vengono endocitati, per esempio da macrofagi, dal sistema reticolo endoteliale, sempre attraverso il recettore del frammento Fc). In alcuni casi questi immunocomplessi sono così tanti che non possono essere endocitati, e accade che precipitano; attraverso l'attivazione del complemento si ha la conseguente attivazione di alcuni frammenti, i quali sono in grado di scatenare una forte risposta infiammatoria; questo può avvenire per esempio in caso di malattie autoimmuni, e avveniva in passato in seguito alla somministrazione di alcuni farmaci. La reazione a farmaci può determinare quindi una risposta di tipo due o di tipo tre; ciò dipende dal farmaco e dalla sue modalità di azione: per esempio se reagisce più con antigeni solubili o con antigeni di membrana. Una delle manifestazioni patologiche relative alla terza tipologia di ipersensibilità è la malattia da siero che si ha quando un individuo viene sottoposto ad inoculo di siero. Una volta si usava come profilassi nei confronti di malattie come le difterite, la somministrazione di siero di cavallo immune, per conferire una resistenza passiva. Questo approccio in passato salvò molte vite, ma come reazione collaterale, l'inoculo di grandi quantità di siero faceva si che l'ospite si venisse a trovare ad interagire con grandi quantità di antigeni sconosciuti, mai visti primi, e quindi di conseguenza poteva avere luogo questo tipo di risposta di ipersensibilità. Se questi antigeni erano presenti, ad esempio, nel torrente circolatorio, potevano dar luogo ad un’infiammazione delle pareti dell'endotelio, o andare a colpire alcuni organi filtranti come i glomeruli renali; in quest’ultimo caso grandi quantità di immunocomplessi precipitando si andavano a depositare sulle pareti dei glomeruli renali, e lì, attraverso l’attivazione del complemento (una cascata complementare) determinavano una risposta infiammatoria tossica per il rene, che non era così più in grado di svolgere la propria funzione di filtrazione.

La reazione di ipersensibilità di quarto tipo è una risposta cellulo-mediata che avviene dopo circa 48 ore. Manifestazioni patologiche tipiche di questa tipologia di ipersensibilità possono essere causate da agenti infettivi, come ad esempio quella che si ha nella formazione di un granuloma nel corso della tubercolosi. La tubercolosi è stata storicamente una delle malattie più studiate. Essa rappresenta l’emblema delle reazioni di ipersensibilità ritardata, anche se si possono riscontrare queste risposte anche nel corso di dermatiti da contatto, ad esempio in seguito all'esposizione di alcuni metalli sulla pelle, cosa che porta ad un rigonfiamento cutaneo e alla formazione di un essudato.

 

Risposta di primo tipo.

E’ detta anche risposta anafilattica ed è mediata dalle IgE. Nell’anafilassi accade che, nel corso di una prima esposizione all'antigene, si verifica la produzione di anticorpi, in particolare di tipo IgE.

Nel momento in cui viene superata la fase acuta ed il sistema ha controllato in qualche maniera la causa che ha scatenato la risposta di tipo IgE, queste specifiche immunoglobuline permangono nel nostro organismo. Queste IgE si vanno a legare sulla superficie di quelle cellule che possiedono recettori per il frammento Fcε, ovvero un recettore che riconosce la regione costante delle IgE. Le cellule particolarmente ricche di questi recettori per il frammento Fc delle IgE sono i mastociti.

I mastociti, quindi, ad un certo punto avranno i loro recettori occupati dalle IgE. Quando c’è una seconda esposizione all’antigene i mastociti si attivano data la presenza delle IgE nella membrana; la reazione è immediata in quanto i mastociti sono dotati di granuli che possono innescare una risposta infiammatoria immediata.

All’interno dei granuli è presente istamina, serotonina, proteasi e citochine come TNF α, quindi nel momento in cui vengono liberati questi granuli dall’interno dei mastociti, si ha una risposta infiammatoria forte e potente. La secrezione di istamina è indotta da IL-3. L’istamina è un vasodilatatore, che aumenta la permeabilità vascolare. La secrezione di istamina comporta, quindi, una diminuzione della pressione sanguigna periferica ed un’attività cardiaca più intensa; l’istamina determina anche contrazione della muscolatura liscia, cosi come la serotonina. Il tumor necrosis factor, invece, comporta anafilassi sistemica. Le proteasi infine determinano secrezione di muco bronchiale e degradazione della membrana basale vascolare. Quando questa risposta assume connotati sistemici, il paziente può morire per collasso dell'apparato cardiocircolatorio.

Le citochine prodotte dai mastociti promuovono il reclutamento dei leucociti, responsabili della fase tardiva della reazione. Le cellule coinvolte in tale reazione sono principalmente eosinofili, neutrofili e cellule Th2. Gli eosinofili e neutrofili liberano proteasi che provocano danno tissutale, mentre i Ly Th2 contribuiscono ad amplificare la reazione producendo altre citochine.

 

Una delle caratteristiche importanti di questa manifestazione è che essa può agire a livello della laringe, all’interno della quale la risposta infiammatoria può essere tanto forte da causare un restringimento del lume della laringe stessa. Uno dei quattro parametri che descrivono una risposta infiammatoria è proprio il tumor, la tumefazione, ovvero il rigonfiamento, che può causare un restringimento del lume della laringe. La ragione del broncospasmo è legata anche all’effetto della contrazione della muscolatura liscia, che tende a restringersi a causa dell’azione di serotonina e istamina. Per indurre una risposta di questo tipo è necessaria l'attivazione di Ly T helper di tipo 2  (con una risposta prevalentemente orientata verso la produzione di anticorpi, con produzione di citochine come la IL-4 e IL-13, che favoriscono lo switch isotipico verso le IgE, ma anche con la produzione di IL-5 e IL-3, che favoriscono la produzione di anticorpi in generale). Il perché vengano prodotti IgE in seguito al contatto con certi allergeni è cosa ancora non nota (ricordiamo che le IgE servono generalmente contro le infezioni da elminti). E' noto che nelle risposte allergiche c'è una certa familiarità, ovvero una certa predisposizione genetica. La familiarità può essere dovuta a motivi diversi come polimorfismi allelici che possono produrre più citochine di un tipo rispetto ad un altro, oppure potrebbe essere dovuta al fatto che alcuni alleli MHC presentano l'allergene in questione in maniera più efficiente ai Ly T helper 2.

 

Ipersensibilità intermedia di tipo 2.

Nel momento in cui un anticorpo, IgM o IgG, si lega ad un antigene sulla superficie di una cellula, quest’anticorpo lega il frammento C1 del complemento. C1 può attivare i fattori C4 e C2, generando due frammenti C4b e C2b, che costituiscono un enzima attivo chiamato C3 convertasi. Questo enzima converte il frammento C3 del complemento in due frammenti, C3a e C3b.

 

Il frammento C3b si localizza separatamente sulla membrana e può associarsi al frammento C5. Questo frammento C5, che si converte in C5a e C5, ha una forma di stiletto, che si incunea nella membrana plasmatica ed una volta incuneatosi, attraverso l’associazione con C6, C7 e C8 in cui viene a formarsi un complesso a forma di stiletto, favorisce l'assemblamento degli altri frammenti C9, creando dei pori sulla membrana plasmatica. Questa cascata complementare è importante perché nel corso della sua attivazione libera alcuni frammenti complementari che sono fondamentali nella risposta infiammatoria. C3a, C4a e C5a sono frammenti che non partecipano direttamente alla cascata complementare perché vengono liberati, ma sono importanti in quanto sono dei mediatori proinfiammatori, e attivano per esempio piastrine ed endoteli; questi frammenti sono, quindi, degli attivatori della risposta infiammatoria.

L’ipersensibilità di tipo 2 è prevalentemente citotossica e questa citotossicità è mediata da cellule NK o dal complemento. Essa è responsabile di alcune risposte come quella che avviene nel rigetto degli eritrociti nel corso di trasfusioni di sangue. Un individuo con fenotipo del sangue A presenta anticorpi contro il fenotipo B. Ad una seconda esposizione agli antigeni B questi anticorpi possono mediare risposte citotossiche, come nel caso dell’eritroblastosi fetale, nel corso della gravidanza.

 

 

Se una donna Rh negativa rimane incinta con un partner Rh positivo, gli eritrociti del feto possono essere Rh positivi e, nel momento in questi eritrociti vengono a contatto con il sangue della madre al momento del parto, quando il sangue del neonato può mischiarsi a quello della madre, questo può causare lo sviluppo di anticorpi contro il fattore Rh. E’ importante notare che le IgG sono le uniche immunoglobuline in grado di attraversare la placenta. In seguito ad una seconda gravidanza la madre possiede già anticorpi IgG contro il fattore Rh e quindi questi anticorpi possono riconoscere gli eritrociti del neonato e dar luogo all’eritroblastosi, all’interno della quale gli eritrociti del neonato Rh positivo vengono uccisi con meccanismi di citotossicità mediati dal complemento o dalle cellule NK. Nell’eritroblastosi fetale il midollo osseo del neonato cerca di sopperire alla carenza di eritrociti cercando di produrne un quantitativo sempre maggiore; tuttavia lo stress a cui è sottoposto il midollo osseo fa si che vengano prodotte forme immature di eritrociti, gli eritroblasti.

Riassumendo: nel corso della prima gravidanza la madre Rh negativa non viene a contatto con gli eritrociti del feto Rh positivo, ma giunge a contatto con essi soltanto nel momento del parto, in cui sviluppa IgM dirette contro il fattore  Rh. Nel corso di una seconda gravidanza le cellule B della memoria già presenti nella donna producono IgG specifiche per il fattore Rh. Queste IgG, essendo in grado di attraversare la placenta, durante la gestazione possono riconoscere e uccidere gli eritrociti di un secondo feto Rh positivo, sviluppando eritroblastosi fetale. La prevenzione a questa malattia avviene attraverso l’induzione di tolleranza nei confronti dell’antigene.

 

Ipersensibilità di terzo tipo.

Nelle reazioni di ipersensibilità di terzo tipo un  ruolo importante è svolto dagli immunocomplessi. Questi immunocomplessi si formano in presenza di alte quantità di antigene, e queste alte quantità di antigene causano la precipitazione delle immunoglobuline che le riconoscono, causando, quindi, la precipitazione degli immunocomplessi; poi avviene la cascata complementare, che si verifica con la liberazione di frammenti C3a, C4a, C5a, le cosiddette anafilotossine; queste anafilotossine hanno un ruolo proinfiammatorio, cioè non partecipano direttamente all’uccisione ma la liberazione di questi frammenti del complemento attiva una risposta infiammatoria sia a carico delle cellule endoteliali che a carico delle piastrine. Se ciò avviene nel tessuto la risposta sarà locale, mentre il problema si verifica quando questa avviene a livello sistemico. I distretti particolarmente colpiti sono i distretti vascolari e gli organi filtranti come il rene. A livello di questi distretti si verifica un danno sia delle membrane endoteliali, sia nei distretti vascolari, sia nelle membrane glomerulari all’interno del rene.

Questi danni si verificano perché nel corso di una risposta infiammatoria acuta avviene, da parte di macrofagi e neutrofili, la liberazione di alcune molecole specifiche che comportano danni locali alle membrane. I neutrofili infatti hanno un emivita molto breve, e una volta trascorsa la loro emivita muoiono, liberando i loro contenuti citoplasmatici; questi contenuti citoplasmatici, caratterizzati per esempio da enzimi lisosomiali e intermedi reattivi dell’ossigeno, sono i principali responsabili del danno locale alle membrane. Quando la risposta è locale, la si può trovare indicata anche come reazione di Arthus.

 

Ipersensibilità di quarto tipo.

Il quarto tipo di risposta di ipersensibilità è quella ritardata. A differenza dei primi tre tipi, in cui la risposta è mediata prevalentemente da anticorpi ed è presente un coinvolgimento di una risposta di tipo Th2, in questo caso prevale una risposta di tipo Th1, una risposta prevalentemente cellulo-mediata. Nel caso in cui in un individuo viene iniettato intradermicamente una certa miscela di proteine caratteristiche del micobatterio della tubercolosi, se l’individuo è già stato precedentemente a contatto con il micobatterio, si innesca un rigonfiamento cutaneo locale, detto ponfo, determinato da una reazione di ipersensibilità di tipo 4. Questo approccio è lo standard per la diagnosi di infezioni da micobatterium. Il corrispettivo istologico di questa risposta è la formazione di un granuloma. Se si inala accidentalmente un micobatterium, questo micobatterio raggiunge il polmone profondo e gli alveoli, a livello dei quali viene fagocitato dai macrofagi alveolari. Una volta fagocitato il micobatterium, i macrofagi alveolari possono dar luogo a varie risposte, una delle quali è appunto una risposta ritardata. Non essendo in genere i macrofagi in grado di uccidere il micobatterio, questi rilasciano citochine e chemochine, dando luogo ad una risposta infiammatoria  e determinando quindi il reclutamento di altre cellule che contribuiscono alla formazione di un nuovo tipo tissutale. In questo caso la strategia dell’ospite, non riuscendo ad uccidere il patogeno, è quella di isolarlo tramite la formazione di un granuloma, che consiste appunto in un nuovo tipo tissutale. Nel granuloma si hanno i macrofagi nell’area centrale e dei Ly negli strati circostanti, circondati da fibroblasti. Questa struttura nel tempo può calcificare ed isolare il micobatterium stesso. La tubercolosi è una classica manifestazione patologica, fondamentale dal punto di vista storico, per lo studio delle cause e delle conseguenze della risposta immune nei confronti del micobatterio; questi studi hanno anche identificato alcuni meccanismi di funzionamento della risposta immune stessa.

 

Approssimativamente 2 miliardi di persone sono infettate dal micobatterium, quindi approssimativamente un terzo della popolazione mondiale è infettata. Una classica domanda d’esame è “essere infettati vuol dire essere malati?” La risposta è no. Essere infettati vuol dire soltanto avere qualche probabilità in più di sviluppare la malattia nel tempo, rispetto a chi non è infettato. Infatti, degli infettati dal micobatterio, solo meno del 10% di essi può sviluppare la malattia negli anni futuri; questo vuol dire che l’ospite in linea di principio è perfettamente in grado di controllare il micobatterium, ad eccezione di alcune circostanze in cui si perde questa capacità e si diventa suscettibili alla tubercolosi.

Essendo approssimativamente il 10% degli infetti ad andare incontro alla malattia nel corso della loro vita, ed essendo il numero degli infetti approssimativamente 2 miliardi, questo indica che circa 200 milioni di persone possono ammalarsi di tubercolosi, con un totale di circa 2 milioni di morti per anno di tubercolosi, e con un decesso ogni 10 secondi. Il micobatterio accompagna l'uomo da tempi immemori e si è ritrovato anche nelle mummie egiziane, in particolare nelle ossa; il micobatterio, infatti, colpisce preferenzialmente i polmoni, determinando tubercolosi polmonare, ma può colpire anche le ossa, dando luogo ad altre manifestazioni patologiche, come la tubercolosi ossea. Nelle mummie si potevano riscontrare calcificazioni derivanti da granulomi, all'interno dei quali è stato isolato DNA di micobatterio.

Koch identificò l'agente eziologico della tubercolosi ed identificò alcuni meccanismi patogenetici della tubercolosi. Il fenomeno di Koch è una reazione di ipersensibilità di tipo ritardato; prendendo il microrganismo e le sue relative miscele proteiche, e inoculandole in animali sperimentali, dovremmo in qualche modo vaccinarli. Ma in realtà avveniva l’esatto contrario: infatti un soggetto sensibilizzato aveva una risposta più forte che causava necrosi tissutale ai polmoni, il meccanismo alla base della tubercolosi polmonare, che viene definita patogenesi immunopatologica. Immunopatogenesi significa che i danni a carico del tessuto colpito, il polmone, sono danni mediati dalla risposta immune. Dal ‘44 è stata scoperta la streptomicina che era efficace nei confronti del micobatterium, ma era tossica. Nel tempo i patogeni hanno acquisito resistenza agli antibiotici, tanto da divenire necessaria una somministrazione di 4 tipi diversi di antibiotici per 6 mesi. Prima del 2000 compaiono quindi ceppi batterici resistenti ai farmaci, ceppi MDR, multidrug-resistant, e nel 2000 compaiono gli XDR (ceppi batterici resistenti agli antibiotici di seconda scelta). Nella terapia farmacologica, infatti, ci sono farmaci standard che devono essere prescritti in maniera standard; tuttavia nel caso in cui si verifica la comparsa di ceppi MDR è necessaria l’introduzione nella terapia di antibiotici di seconda scelta, che sono più efficaci ma hanno anche livelli di tossicità più elevati. Gli XDR sono ceppi batterici resistenti anche agli antibiotici di seconda scelta. Il motivo per cui solo il 5-10% degli infettati dal micobatterium si ammala di tubercolosi deriva dal fatto che l’ospite è normalmente in grado di controllare il patogeno, ma in presenza di condizioni particolari le probabilità di insorgenza della malattia aumentano; queste condizioni sono povertà, malnutrizione, alcolismo, presenza di ceppi farmaco resistenti, ed infine pandemia di HIV, che rende l’ospite immunodepresso e quindi più soggetto all’insorgenza di tubercolosi.

Dopo l’inalazione del micobatterio ci possono essere diverse possibilità: si può avere in primo luogo una spontanea eliminazione del patogeno attraverso il coinvolgimento di elementi della risposta innata importanti; elementi della risposta innata che possono essere in grado di  prevenire un’infezione aerosolica sono il muco ed il flusso ciliare, che impediscono al micobatterio di raggiungere il polmone profondo. Un’altra possibilità è che il patogeno possa trovare dei tipi cellulari in grado di ucciderlo, ovvero può trovare dei tipi cellulari che sono molto attivi all'interno di un determinato microambiente, il quale consente un'attivazione talmente efficiente di queste cellule da metterle in grado di uccidere il patogeno. E' relativamente difficile stabilire l'importanza di questo processo infettivo perché è difficile capire se una persona è stata esposta oppure no al micobatterio, ma si ritiene che questo meccanismo possa avvenire in circa il 40-50% delle persone esposte. Se una persona altamente esposta, come le persone che vivono a contatto con pazienti infettati dal micobatterio, rimane ancora negativa al test della tubercolina, ciò indica che la sua risposta innata è stata tanto forte da non richiedere neanche il coinvolgimento della risposta adattativa.

Negli altri casi in cui il micobatterio raggiunge il polmone, questo patogeno si replica e si forma un complesso primario caratterizzato da macrofagi che avvolgono il micobatterio che si sta replicando;

questi macrofagi rilasciano citochine e chemochine, che reclutano nuovi tipi cellulari, ovvero macrofagi e linfociti; queste cellule hanno lo scopo di avvolgere e contenere il micobatterio all’interno di questa struttura, che prende il nome di granuloma. La formazione di un granuloma è il riflesso di tipo istologico di una reazione di ipersensibilità di tipo ritardato. Il granuloma comporta danno tissutale ma riesce ad inibire la crescita del micobatterio. L’entità del danno tissutale determinato dal granuloma dipende dalla capacità che ha il sistema di inibire la crescita del micobatterio.

La tubercolosi miliare è molto estesa e coinvolge tutto il parenchima polmonare. Attraverso il danno tissutale si verifica distruzione di una zona del parenchima, dove si vengono a formare delle cavità; alcune di queste sono particolarmente grandi e vengono dette caverne; se queste cavità, all’interno delle quali il patogeno si sta replicando vengono a contatto con le terminazioni finali dell’albero broncoalveolare, il contenuto di queste cavità può riversarsi all’interno di queste terminazioni broncoalveolari ed il paziente diventa infettivo per gli altri. Quindi nel momento in cui il granuloma si espande può erodere l’epitelio bronchiale, per danno tissutale, ed il suo contenuto può riversarsi nelle terminazioni broncoalveolari, ed il paziente attraverso colpi di tosse può diventare infettivo per la comunità, dando luogo al fenomeno della trasmissione.

Nel caso di disseminazione l’infezione non è contenuta, e ciò dipende dall’equilibrio tra la risposta dell’ospite e la capacità del micobatterio di evaderla. Il sistema immune è efficiente nel contenere il micobatterio, e questa efficienza può durare tutta la vita; tuttavia ci sono determinate condizioni che favoriscono stati di immunodepressione, come la malnutrizione, l’alcolismo, l’HIV, che aumentano le possibilità di insorgenza della patologia, in cui il micobatterio evade le risposte dell’ospite. Le aree depresse del mondo sono più suscettibili a questa malattia, proprio per l’immunodepressione che è caratteristica di queste regioni; tuttavia anche in occidente c’è un ritorno di infezioni, in quanto l’aumento di benessere ha determinato una maggiore differenza tra frange di popolazioni ricche e frange di popolazioni povere che possono vivere in uno stato di immunodepressione che può portare queste persone a sviluppare più facilmente questa malattia. E’ importante sottolineare però che essere stati a contatto con il micobatterio, quindi essere positivi al test della tubercolina, non necessariamente indica una maggiore probabilità di sviluppare la tubercolosi nel corso della vita, quindi non si vive costantemente su un filo, ma la suscettibilità dipende dai fattori precedentemente citati, relativi all’immunodepressione. Una persona positiva al test della tubercolina non necessariamente indica che questa persona è infetta, ma semplicemente che è venuta a contatto nel corso della sua vita con il micobatterium tubercolosis, e, come conseguenza, o lo ha eliminato, o il patogeno è stato isolato e quindi rimane quiescente nell’individuo nel corso della sua vita; tuttavia nel secondo caso, se si usano farmaci immunosoppressori, oppure si verificano altre condizioni, come le precedentemente descritte malnutrizione, HIV ecc.. l’immunodepressione dell’individuo può aumentare le possibilità di insorgenza della malattia, ed il micobatterio da uno stato isolato può aggirare le difese dell’organismo, oppure un individuo mai stato a contatto con il micobatterio è più facilmente soggetto all’infezione. Coloro che sono stati infettati dal micobatterio hanno un maggiore orientamento a sviluppare una risposta di tipo Th1, il che potrebbe per certi versi addirittura favorirli per altre cose; infatti una delle terapie che viene usata per il cancro alla vescica è l'instillazione in situ di BCG (micobatterium bovis attenuato), un micobatterio che determina una risposta di tipo Th1, che viene proprio attivata dalla presenza del micobatterium.

Trasmissione-Disseminazione: c’è trasmissione nei casi in cui in un individuo infetto viene erosa la parete dell’epitelio alveolare e quindi il patogeno, a partire dalle cavità determinate dal danno tissutale al parenchima polmonare, può riversarsi all'interno delle terminazioni bronco alveolari, ed essere diffuso all’esterno (per esempio attraverso la tosse); c’è invece disseminazionese invece della parete dell’epitelio alveolare viene erosa la parete endoteliale dei vasi polmonari e a quel punto si può avere disseminazione ematogena, una disseminazione del patogeno attraverso il circolo ematico. In questo caso si possono avere delle forme di tubercolosi dette miliari, in cui le lesioni sono disseminate e colpiscono diverse aree del polmone. Queste forme di tubercolosi sono più difficili e più gravi poiché è tutto il polmone ad essere colpito e non è presente soltanto una caverna a livello di una regione di parenchima, ma è l’intero parenchima polmonare ad essere colpito. Si possono avere anche disseminazioni extrapolmonari, in cui il patogeno può essere diffuso attraverso il flusso ematico e può colpire organi diversi dal polmone, come le ossa o il cervello, determinando, per esempio, la meningite tubercolare nel caso in cui colpisce il cervello.

 

Patologia

 

Tubercolosi e HIV                                                                                             Lezione 5 del 26.11.07

 

Meccanismo patogenetico della tubercolosi.

L'ipersensibilità di tipo ritardato, di quarto tipo, si dice tale perché avviene dopo 48-72 ore, con la formazione di un granuloma e di una risposta cellulo-mediata. Il fatto che sia mediata da cellule ci suggerisce che sono coinvolti i Ly T citotossici (cd8) e i Ly T helper 1 (cd4). I Ly T helper secernono citochine per mediare la risposta immunitaria: i T helper 1 sono orientati prevalentemente verso l'attivazione di una risposta cellulo-mediata mentre i Ly T helper 2 sono orientati verso una  risposta umorale. La risposta di ipersensibilità di tipo ritardato è una risposta cellulo-mediata quindi mediata dai Ly T helper 1. Una risposta di ipersensibilità di tipo 4 genera la formazione di un granuloma. La classica risposta di ipersensibilità di tipo ritardato è quella che si osserva nei confronti del Micobatterium tubercolosis.

Una volta inalato il micobatterium, esso va ad infettare alcune cellule, prevalentemente i macrofagi alveolari deputati alla sua fagocitosi. Una volta fagocitato, il micobatterium non viene ucciso in quanto riesce ad evadere molte delle risposte dell'ospite. Esso riesce, ad esempio, ad inibire la maturazione del fagolisosoma. Normalmente un microrganismo che viene fagocitato da un macrofago si trova immerso nel citoplasma del macrofago, formando una vescicola rivestita da membrana detta fagosoma. In seguito all’inglobazione del microrganismo si attiva un processo per cui il fagosoma viene avvicinato ai lisosomi fino a fondersi con essi formando il fagolisosoma. Il materiale fagocitato viene così a contatto con vari enzimi contenuti nei lisosomi e quindi digerito. Per quanto riguarda il micobatterium, esso riesce ad inibire la maturazione del fagolisosoma, risiedendo nei compartimenti endosomiali immaturi; il micobatterium ferma, infatti, il processo di maturazione del fagolisosoma ad uno stadio immaturo, all'interno del quale gli enzimi lisosomiali sono inattivi. Questo non è l'unico meccanismo attuato in quanto il micobatterium riesce anche ad alcalinizzare il pH del fagolisosoma. Un fagolisosoma ha generalmente un pH acido ma, nei casi in cui il micobatterium non riesce ad inibirne la maturazione, produce ioni ammonio che alcalinizzano il pH, non permettendo quindi l'attivazione degli enzimi lisosomiali, che sono attivi invece a pH acido. Altra possibilità del micobatterium è quella di uscire dai compartimenti fagolisosomiali andando a colonizzare il citoplasma, dove non può essere attaccato. Il micobatterium, interferendo con la maturazione del fagolisosoma, interferisce negativamente anche sulla capacità di presentazione antigenica da parte del macrofago stesso. Interferendo con la capacità di presentazione antigenica (vedi immunologia), riesce ad evadere anche dalla risposta adattativa.

L'eliminazione di questo batterio è quindi molto complicata. La cellula non può far di meglio che produrre citochine e chemochine che richiamano linfociti e monociti. Non potendo eliminare il patogeno, l'ospite cerca, con il granuloma, di isolarlo. Un granuloma è costituito, procedendo dal centro verso la periferia, da micobatteri e macrofagi al centro, i quali sono circondati da una corona di linfociti, attorno alla quale si deposita uno strato di fibroblasti. Al centro del granuloma è presente, inoltre, materiale necrotico, che ha una consistenza caratteristica: questa zona è chiamata zona di necrosi caseosa perché ricorda la consistenza del formaggio fuso; essa non è altro che materiale amorfo derivato da cellule morte. Queste cellule sono morte in seguito all'attivazione della risposta immune, all'interno della quale il sistema non riesce ad uccidere il micobatterio ma si attiva in continuazione. Ripetendo, dopo che il micobatterium è stato trasmesso, esso raggiunge il polmone profondo; qui il macrofago produce citochine e si forma un piccolo granuloma all'interno del quale il materiale cellulare solidifica formando la zona di necrosi caseosa. Nel tempo, siccome il mantenimento della struttura granulomatosa è un processo dinamico che coinvolge la risposta adattiva, quando questa risposta si riduce, il micobatterio riprende a replicare ed in qualche modo questa zona va incontro a liquefazione (da solido a liquido); questo zona ora liquefatta rappresenta una sorta di terreno di coltura dove il micobatterio può crescere. Il mantenimento del micobatterio all'interno della struttura granulomatosa è sottoposto ad un equilibrio: se la risposta immune è tale da inibire la crescita del micobatterio, il granuloma si chiude ed il materiale si solidifica, ma, se questo non è possibile perché l'individuo è immunodepresso, il micobatterio tende a replicare ed il granuloma vanno incontro a liquefazione, espandendosi ed aumentando il danno polmonare. Nel momento in cui un individuo non è più in grado di controllare il micobatterio, questo patogeno a partire da uno stato di latenza, ricomincia a replicare. Ripetendo un'ultima volta per essere più chiari: la liquefazione è un processo successivo alla necrosi caseosa. La necrosi è riferita al tessuto e non alle cellule che formano il granuloma. Quando si forma il granuloma, si forma quella struttura detta di necrosi caseosa perché le cellule, una volta che muoiono, danno luogo a questa formazione che ricorda la consistenza del formaggio fuso: una zona biancastra all'interno di questi granulomi. Questa necrosi è causata dalla risposta immunitaria che induce la necrosi. Se in determinate circostanze la risposta diventa meno efficiente, questa zona liquefa, ed in questa sorta di brodo che il micobatterio può anche replicare a livello extracellulare, cosa che di solito non fa essendo un parassita intracellulare essenzialmente dei macrofagi. In questa malattia si parla di immunopatologia perché il danno tissutale è mediato dalla risposta immunitaria stessa. Il sistema immunitario, nel cercare di arginare il micobatterium tramite la sua risposta infiammatoria, genera danno tissutale, per questo si chiama risposta immunopatologica. Essere infettati non vuol dire essere malati. Il danno tissutale è più grave quando la risposta infiammatoria è più alta. Esiste un equilibrio: se il micobatterio viene limitato allora la risposta immunitaria non è dannosa ma, se non viene limitato, una forte risposta immunitaria genera più danni.

L'interferone γ prodotto dai Ly T helper 1 stimola la risposta cellulo-mediata attivando il macrofago ed aumentando la sua capacità microbicida e di presentazione antigenica. Purtroppo non esistono dei dati inequivocabili sulla vera efficacia di una risposta mediata da interferone γ e quindi sul suo possibile impiego come farmaco. Non si conoscono ancora quali sono in realtà dei buoni correlati di protezione. Questo, quindi, comporta che, se nel tempo accade qualcosa che deprime il sistema immunitario, il micobatterio riprende la sua attività, riattivando la sua replicazione. In questo caso si parla di reinfezione endogena. Un soggetto che è immunodepresso o immunodeficiente perché è sieropositivo per l'HIV e quindi carente in Ly T cd4 antigene specifici, ha alte probabilità di sviluppare tubercolosi. La combinazione di queste due infezioni fa si che tutte e due le patologie si aggravino. Un tubercolotico infettato anche dall'HIV, in questo caso, ha dei granulomi più piccoli ed è in teoria meno infettivo per gli altri rispetto ad un HIV negativo. Questo perché il granuloma rimane di piccole dimensioni e non invade le vie alveolari; non erode quindi gli epiteli alveolari. Ci può, però, essere disseminazione ematogena. Il granuloma non si ingrandisce e non fa caverne ma, siccome gli alveoli vengono erosi, il micobatterio può entrare in circolo e diffondere nel sangue. Una delle caratteristiche di questi soggetti è la tubercolosi miliare con tanti piccoli granulomi disseminati nel polmone.

Uno dei grandi problemi di questa malattia è il sistema di diagnosi che si basa sull'inoculo di un infiltrato di proteine micobatteriche detto PPD (purified protein derived) anche detto test della tubercolina, in cui viene inoculato all'interno del braccio questa miscela proteica aspettando una eventuale risposta di ipersensibilità di tipo ritardato da parte del paziente. Se nella zona di inoculo si viene a formare una tumefazione o rigonfiamento, quello che si chiama ponfo, ciò indica che l'individuo è venuto a contatto con il micobatterio. L'unico vaccino esistente per la tubercolosi prevede la somministrazione del BCG (ceppo attenuato del Micobatterium bovis) un ceppo parentale attenuato. Questo BCG è un bacillo vivo che viene inoculato in aree depresse del mondo già da uno o due giorni di vita. Esso protegge da tubercolosi disseminate come nel caso della meningite tubercolare. Se per vari motivi non viene a formarsi un granuloma, il micobatterio può disseminare e dare luogo a meningite tubercolare, uccidendo il bambino. Tuttavia questo vaccino non permette di evitare una tubercolosi polmonare dell'adulto, la forma più comune. La strategia vaccinale nei confronti della tubercolosi può rappresentare una strada vincente? No. Quando inaliamo il micobatterio, nel 90-95% dei casi non ci ammaliamo, salvo forse ammalarci successivamente negli anni, nel momento in cui possiamo essere in uno stato di immunodepressione. Il vaccino non riesce comunque ad immunizzare contro questo patogeno. Un vaccino dovrebbe essere dotato di antigeni derivati dal patogeno ma questo avviene anche normalmente quando il micobatterium non causa malattia (comunque entriamo in contatto con i suoi antigeni), quindi un vaccino di questo tipo non ha efficacia effettiva. Studi genetici di una maggiore resistenza sono stati fatti andando a vedere gli alleli MHC ed il metabolismo della vitamina D (che sembra essere coinvolto); essi però non hanno portato a grandi risultati. Il patogeno perfetto dovrebbe tendere all'equilibro tra la capacità di uccidere la popolazione e la capacità di farla sopravvivere (altrimenti morirebbe anche il patogeno stesso). Il micobatterio si è quindi adattato alla nostra specie da migliaia di anni. La strategia del vaccino non è da non percorre, ma andrebbe percorsa solo a patto che si conoscano bene quali sono i correlati di protezione dell'organismo che vengono coinvolti. Se sapessimo quali cellule della risposta adattativa rendono in grado il macrofago di arginare la risposta batterica, allora potremmo avere delle possibilità. Stiamo parlando di una immunopatologia e noi non conosciamo bene la caratteristica di quei cloni che mediano una risposta protettiva. Ancora fino ad ora abbiamo troppo sottovalutato il ruolo della risposta innata. Se è vero che il macrofago limita la crescita del patogeno, dobbiamo attivare il macrofago o tramite un Ly T cd4 particolare (quindi tramite un vaccino particolare) o tramite altre strategie; l'importante è che l'obiettivo finale sia lo stesso, quello di potenziare la capacità microbicida del macrofago. Esiste quindi un equilibro tra cellule T protettive e cellule T proinfiammatorie. Quelle “protettive” sono quelle capaci di attivare il macrofago ed uccidere il micobatterio, mentre quelle “proinfiammatorie” sono quelle capaci di aumentare il processo infiammatorio e quindi il danno tissutale. Non tutte le persone rimangono infettate, ma alcune riescono ad uccidere il patogeno, quindi un mezzo ci deve essere. L'organo d’elezione colpito dalla tubercolosi è il polmone e la diffusione avviene solo per inalazione (quindi non dal sangue e dalla saliva). La capacità di trasmettere i bacilli è direttamente proporzionale al danno tissutale; infatti il bacillo può essere trasmesso solo se le cavità alveolari sono venute a contatto con le terminazioni aeree, in conseguenza di un danno tissutale da granuloma.

 

HIV.

Tubercolosi e HIV sono due malattie associate perché i due patogeni dialogano tra loro; c'è quindi una connessione tra le due malattie. L'incidenza delle due malattie è sovrapponibile nelle stesse aree geografiche. Queste due malattie, insieme alla malaria, sono dette malattie legate alla povertà.

Il virus HIV usa alcuni recettori della cellula ospite per l'adsorbimento; questi recettori sono il cd4 e dei corecettori che appartengono alla classe dei corecettori delle chemochine come ccr5 o cxcr4, ma possono essercene anche altri. Il virus si lega al recettore ed entra nella cellula, l'RNA virale viene retrotrascritto dalla trascrittasi inversa per formare la doppia copia di DNA, che può integrarsi nel genoma della cellula ospite e rimanere in stato silente. Nel momento in cui la cellula ospite si attiva, il DNA produce RNA, attraverso la trascrizione, l'RNA virale produce proteine ad alto peso molecolare che vengono tagliate da proteasi del virus, e quindi le diverse proteine correttamente tagliate possono formare il capside del virus e gemmare dalla superficie tramite estroflessioni della membrana plasmatica. Ci sono diverse classi di enzimi che agiscono come la trascrittasi inversa, le integrasi e le proteasi. Diversi farmaci che vengono usati sono analoghi nucleosidici e non nucleosidici che agiscono sulla trascrittasi inversa, ma possiamo anche avere degli inibitori delle proteasi. Il rilascio per estroflessione, tramite la membrana plasmatica, fa si che il virus abbia sulla sua membrana delle proteine dell'ospite. Il virus HIV è caratterizzato dal possedere un tipo particolare di glicoproteina, la gp120 che è associata ad un'altra glicoproteina la gp41 anche se, come è stato detto prima, intervallate nella membrana possono esserci delle molecole dell'ospite.

 

Marcatori di laboratorio per infezioni di HIV.

Per vedere se siamo sieropositivi si va a vedere se possediamo nel siero anticorpi nei confronti del virus. La presenza di anticorpi riflette l'esposizione del virus e quindi funziona come saggio di diagnosi della malattia. Queste analisi vengono fatte tramite elisa o western blotting.

Altri sistemi di laboratorio per monitorare invece i pazienti affetti sono, ad esempio, il dosaggio dell'antigemia del p24, antigene del core del virus, in particolare del capside, che viene rilasciato quando la viremia si alza. Se dosiamo questo antigene nel sangue questo è sintomatico della replicazione del virus. Un altro sistema per monitorare il paziente è fare la conta dei cd4, in quanto l'elemento immunopatogenetico fondamentale è che l'infezione di HIV causa immunodeficienza dovuta alla perdita dei Ly T helper cd4+. Un altro metodo di dosaggio della viremia consiste nell’andare a misurare il numero di copie di RNA virale rilevato nel sangue: questo sistema lo si effettua tramite PCR.

Per ricapitolare quindi, attraverso un'indagine sierologica si effettua diagnosi della malattia ma l'uso di ulteriori indagini può chiarire l'andamento dell'infezione come la viremia e/o la conta dei cd4.

 

Infezione.

L'infezione è caratterizzata da diversi stadi di infezione primaria che ricordano molto i sintomi di altre infezioni virali, come la comparsa di febbre, stanchezza, l'ingrossamento dei linfonodi ecc..

Dopo questo stato primario si ha una forma asintomatica di infezione cronica dove l'individuo è asintomatico quindi non sta male e non è particolarmente immunodepresso: le sue conte di cd4 sebbene più basse, rimangono infatti nella norma, sopra i 400 per microlitro (limite inferiore); questo stadio può durare anche molti anni. C'è successivamente uno stadio in cui avviene la comparsa della sintomatologia. Questo avviene nel momento in cui l'individuo comincia ad essere immunodepresso, quindi con una diminuzione progressiva dei Ly T cd4, che scendono sotto i 200 per microlitro. Possiamo quindi avere la comparsa di malattie opportunistiche che normalmente non si avrebbero: candidasi della mucosa orale, infezioni da parte del pneumocystis pneumonia, tumori come il sarcoma di Kaposi o tubercolosi, tutti sintomi di una forte immunodepressione. La comparsa di questi sintomi identifica l'individuo come soggetto in AIDS conclamato (sindrome da immunodeficienza acquisita). Quando facciamo la conta dei cd4 e stimiamo circa 300 cd4 su microlitro, potrebbero essere collassati tutti i Ly antigene specifici per quel patogeno, cosa che comporta chiaramente l'infezione e la malattia che determina quel particolare patogeno. La diminuzione dei Ly T cd4 è un parametro importante ma che va comunque considerato entro i suoi limiti in quanto è un parametro grossolano. Infatti si potrebbero avere alte conte di Ly T cd4 ma avere allo stesso tempo un effetto di immunodeficienza, come la comparsa di alcune delle patologie precedentemente citate, associate all’AIDS, a causa dell’eliminazione di alcuni cloni di Ly T specifici per quei patogeni. I Ly T sono, infatti, distribuiti clonalmente ed ognuno di loro è specifico per un antigene: se vengono meno proprio quei Ly T antigene specifici verso un patogeno, quel patogeno potrà propagarsi facilmente nell’organismo senza subire una risposta immunitaria.

 

Tempo di latenza del virus.

Sulla base del tempo di latenza possiamo distinguere i pazienti in diversi tipi:

• Possiamo avere pazienti detti “long term non-progressor” in cui il tempo di latenza è tanto lungo che essi non subiscono progressione della malattia. Questi soggetti sembrano avere risposte immunitarie particolarmente efficienti. Alcune prostitute di Nairobi non si infettavano anche se venivano a contatto con il virus; esse sembravano essere naturalmente protette. Sfortunatamente per loro però dopo alcuni anni si sono infettate e sono morte. In alcune situazioni alcune risposte immuni possono quindi controllare l'infezione ma ancora non si sa bene cosa è coinvolto in questi processi. In questo caso, quindi, le copie di Ly T cd4 rimangono stabili per vari anni.
• Possiamo avere pazienti “intermediate progressor” con tempo di latenza medio di 5-6 anni, periodo dopo il quale le copie di virus si alzano ed i Ly T tendono a a zero.
• Infine abbiamo i “rapid progressor” in cui, a causa di alti livelli di viremia, nel giro di 1-2 anni si va incontro a morte.

 

Risposta immunitaria.

Che tipo di risposta si produce nei confronti del virus? E’ presente una risposta anticorpale come quella mediata dagli anticorpi neutralizzanti che bloccano l'ingresso del patogeno nella cellula ospite. Questi anticorpi neutralizzanti sono quelli diretti verso le glicoproteine di superficie gp120 o gp41. Purtroppo il virus, essendo a RNA, muta molto in quanto la trascrittasi inversa fa errori. Questi errori possono da una parte generare una progenie virale non in grado di produrre un virione maturo ma si possono anche selezionare virus che sono in grado di evadere questo tipo di risposta immune. E’ presente quindi un processo di selezione naturale.

Abbiamo anche anticorpi enhancing che aumentano il processo infettivo anche se non si sa bene come. Si pensa che opsonizzino il virus così da farlo fagocitare da cellule macrofagiche, all’interno delle quali può avvenire l'infezione e la replicazione, o anche che possano dare una risposta ADCC, causando comunque sempre lo stesso effetto finale sui macrofagi.

Altra risposta è quella mediata dalle cellule T. In genere una risposta antivirale efficiente è quella citotossica, che è anche quella che distrugge i Ly T cd4 infetti. Questo tipo di risposta, per poter essere attiva, richiede che i Ly T cd4 si attivino dando luogo però alla replicazione virale che determina una esposizione delle componenti proteiche virali sulla membrana della cellula T infettata. Il virus quindi, quando si attiva la cellula T cd4, replica all'interno di questa in quanto, quando si integra nel genoma, le sue sequenze terminali LTR si integrano e vengono attivate dal fattore di trascrizione nucleare NF-Kb (che comporta sviluppo, maturazione e proliferazione delle cellule T), generalmente attivato per trasduzione del segnale da recettori di tipo Toll o da citochine proinfiammatorie. Non è un caso che NF-Kb, che genera un microambiente proinfiammatorio, sia quello che attiva il virus a replicare; non è un caso perché il virus, per poter replicare, deve poter usare un macchinario intracellulare efficiente per replicarsi ed infettare altre cellule.

Si arriva quindi all'immunodeficienza quando i cloni cd4 scendono, sia perché il virus li infetta, causando un effetto citopatico, sia anche tramite meccanismi indiretti che possono causare la morte anche di cellule T non infette. Tra questi meccanismi indiretti abbiamo quello che può coinvolgere la formazione di sincizi. Questi sincizi si formano perché i Ly T cd4 che hanno espresso sulla loro membrana molecole di gp120 prodotte nel corso della trascrizione virale, una volta espresse in membrana, possono legarsi a molecole cd4 di altri Ly T cd4 causando quindi la fusione delle cellule, ovvero un sincizio in cui le cellule non sono più funzionali. Per ricapitolare: le gp120 sulla membrana di un Ly T cd4 si legano alle molecole cd4 di un'altra cellula T non infettata formando sincizi e uccidendo la cellula non infettata oltre a quella infettata. I pazienti che hanno virus in grado di formare sincizi hanno una prognosi più grave, questo perché ci sono virus che hanno una tendenza maggiore a sviluppare sincizi rispetto agli altri.

Oltre a questi ci possono essere anche altri meccanismi come quello dell'apoptosi, che può essere indotta nel momento in cui viene prodotta e rilasciata la gp120, che può prendere contatto con il cd4 di membrana di un Ly T, ad esempio. La Gp120, una volta rilasciata, può dar luogo ad un cross linking con anticorpi anti-gp120 che vanno a legarsi ai cd4 di membrana di un Ly T non infetto (primo segnale per la morte cellulare per apoptosi). Successivamente alla formazione del cross linking che forma un “superantigene”, quando il Ly T viene attivato dalla presentazione dello stesso antigene da parte di una APC (secondo segnale per la morte), la cellula è resa suscettibile all'apoptosi. In presenza di questi due segnali si ha quindi un'attivazione impropria dell'apoptosi.

Quando si parla di immunodepressione dobbiamo tener presente che il conto dei cd4 ci da un'idea dell'immunodeficienza e non dell'immunodepressione, che dipende invece dalla risposta antigene specifica e non tanto dal numero dei Ly T. Se si verifica un calo del numero dei Ly T cd4, ci sarà un conseguente calo della riposta antigene specifica, ma se c'è un calo della risposta antigene specifica, questo non comporta per forza che il numero di cd4 sia basso. Circa un Ly T antigene specifico è presente ogni 1000-10000 cellule, questo è il range standard. L'eliminazione di questi cloni potrebbe non essere visualizzabile in base al numero dei linfociti, ma, per non avere più una risposta memory, basta eliminare quel clone ogni 1000 o 10000 cellule.

Se è presente un'infezione cronica come quella del micobatterium tubercolosis, e sappiamo che la formazione del granuloma ed il suo mantenimento è una cosa dinamica che richiede contemporaneamente l'intervento dei Ly T cd4, sapendo che l'HIV può infettare le cellule cd4 come i Ly T helper ed i macrofagi, un macrofago infettato dall'HIV, quando presenta un antigene, oltre ad attivare il Ly T, può tramettere il virus durante la formazione della sinapsi immunologica (stretta vicinanza tra APC e Ly T). Nel corso di questa sinapsi immunologica di riconoscimento, il macrofago attivato che produce NF-Kb, attiva le replicazione del virus così che esso possa infettare i Ly T antigene specifici per la tubercolosi. La tubercolosi è quindi una malattia che, nel corso di una infezione di HIV, non si verifica soltanto quando i Ly T calano di numero, ma anche quando è presente un numero abbastanza normale di cd4. Il problema non è infatti nel numero ma piuttosto nella qualità dei Ly T cd4, ovvero nella disponibilità di cloni antigene specifici.

Patologia

HIV e relazioni con la tubercolosi                                                                    Lezione 6 del 28.11.07

 

Infezione di HIV.

Una caratteristica patogenetica che avviene nel corso di una infezione da HIV è la progressiva perdita della risposta memory, quindi la perdita della risposta verso gli antigeni di richiamo.

E’ stato visto nella scorsa lezione che si ha una perdita nella qualità della risposta più che nella quantità dell’antigene specificità; nel tempo inoltre si osserva una sorta di shift da una risposta di tipo Th1 ad una riposta di tipo Th2. Questo è caratteristico perché la risposta Th1 è particolarmente efficiente nei confronti di microrganismi intracellulari, poiché promuove una risposta di tipo cellulo-mediata. Si ha quindi una progressiva perdita di questo genere di risposta, dovuta al fatto che nel tempo, una caratteristica dell'infezione, è l'attivazione di quei cloni linfocitari antigene specifici che comporta una maggiore suscettibilità all’attivazione e alla replicazione del virus, e quindi alla distruzione degli stessi Ly T che sono stati infettati. Per potersi replicare il virus HIV necessita infatti dell'attivazione del fattore di trascrizione NF-Kb, che agisce da stimolo proinfiammatorio e che determina la proliferazione del Ly T cd4; questo fattore di trascrizione va a legarsi presso le sequenze LTR, long terminal repeats, del genoma virale, dando inizio alla sua trascrizione. E’ evidente, quindi, che per potersi verificare un’attivazione del processo virale è necessario che la cellula T infetta si attivi tramite il suo fattore di trascrizione nucleare NF-Kb; un Ly T infatti si attiva generalmente nel corso di un riconoscimento antigenico. Muoiono quindi quei Ly antigene specifici che si sono attivati, perché hanno permesso al virus di replicare al loro interno. Quindi il riconoscimento antigenico determina l’attivazione dei Ly T cd4 infetti da HIV con conseguente replicazione del genoma virale al loro interno.

Per il dosaggio dell’antigemia viene impiegata la proteina P24, una proteina del capside virale che viene rilasciata quando la viremia si alza. Quando si parla inoltre di gp120 e di gp41 si fa riferimento ad un complesso molecolare che si chiama complesso gp160.

La proteina virale gp120, per poter effettuare un’infezione produttiva, deve legarsi al recettore cd4 della cellula ospite. Per questa ragione infatti possono essere infettati non soltanto i Ly T helper ma anche altre tipologie di cellule, come le cellule appartenenti alla linea monocito-macrofagica. L’infezione delle cellule appartenenti alla linea monocito-macrofagica svolge un ruolo chiave nella patogenesi dell'infezione da HIV.

 

Nel meccanismo di ingresso del virus HIV la proteina virale gp120 prende contatto con il recettore cd4 della cellula ospite tramite il sito di legame cd4 binding site. Questo riconoscimento tra gp120 e recettore cd4 promuove l'esposizione di una regione della gp120, che può legarsi ad un corecettore presente sulla membrana plasmatica della cellula ospite; questo corecettore è in realtà, nel suo ruolo fisiologico, un recettore per le chemochine, che quindi promuove la migrazione delle cellule nei siti dell'infiammazione. Nel caso della infezione da Hiv questa molecola si comporta da corecettore del virus; quindi normalmente lega le chemochine ma nei casi di infezioni da HIV si comporta da corecettore del virus. Questa molecola prende contatto, come è stato già detto, con una regione della gp120, esposta dal legame tra gp120 e recettore cd4; questo ulteriore contatto espone un peptide della gp41 che è fusogenico, che ancora la membrana del virus a stretto contatto con la membrana della cellula ospite, favorendone la fusione, così da permettere l’inserimento del materiale genetico virale all’interno della cellula ospite. Tutti i meccanismi che comportano l'ingresso di un virus in una cellula ospite possono essere suscettibili all’azione di anticorpi neutralizzanti, e quindi conoscere questi meccanismi può essere anche utile in termini terapeutici.

 

Tipologie di virus HIV e corecettori usati.

Si possono distinguere diverse tipologie di virus a seconda del tipo di corecettore che essi utilizzano. Tutti i virus utilizzano a livello di tempistica cd4 come recettore primario; quindi tutti i virus prendono contatto prima con il recettore cd4 e poi successivamente con un corecettore specifico per le chemochine.

• Esistono virus HIV R5 che sono quei virus che mediano l'entrata all’interno della cellula ospite usando come corecettore il ccr5, che è un recettore per tre diversi tipi di β chemochine: mi α, mi1 β e rantes. Il riconoscimento tra le chemochine ed i loro recettori è un sistema estremamente ridondante, nel senso che un recettore può legare più di una chemochina, come nel caso di ccr5, ed una chemochina è in grado di legare più di un recettore. I virus R5 sono, quindi, quelli che prendono contatto con i recettori ccr5 della cellula ospite.
• Un’altra tipologia di virus sono gli X4; i virus X4 sono quei virus che dopo aver preso contatto con il recettore cd4 vanno a legarsi presso un corecettore della cellula ospite chiamato cxcr4. Questo corecettore lega come chemochina conosciuta l'sdf1; è importante la distinzione tra virus X4 e virus R5 in quanto queste due tipologie possono rappresentare momenti diversi dell'infezione.
• Oltre a queste due tipologie di virus ne esiste un terzo tipo che sono i virus R5X4 che possono legare in maniera indiscriminata sia corecettori ccr5 che corecettori cxcr4, oltre ad altri recettori  ccr2 ecc...

In genere i corecettori per le chemochine vengono espressi su cellule diverse:

• Il ccr5 è in genere espresso sui fagociti mononucleati a livello basale (anche se la sua espressione può incrementare in maniera inducibile) ed è espresso anche sui Ly T cd4 attivati, quindi solo in seguito alla loro attivazione.
• Il cxcr4 non è normalmente espresso sui fagociti mononucleati (monociti, macrofagi) eccetto quando essi si attivano a seguito di infezioni microbiche, ma è espresso in maniera costitutiva su tutti i Ly T cd4.

Tenendo presente questa distinzione nell’espressione tra questi due recettori, ciò che si è visto è che i virus che mediano la prima infezione, cioè quelli che vengono trasmessi e danno luogo ad un’infezione produttiva in soggetti naif, sono i virus di tipo R5. Questi virus R5 nel tempo danno luogo ad una progenie virale di tipo X4, ovvero a virus che legano il recettore per le chemochine cxcr4. A questo punto ci si può porre alcune domande: innanzitutto perché nei primi stadi di infezione vengono utilizzati prevalentemente i virus di tipo R5? e quali sono le modalità di trasmissione più frequenti? Le modalità più frequenti di trasmissione, a parte il sangue, sono quelle che utilizzano le mucose; nelle mucose sono presenti cellule della risposta innata, come sistema di sorveglianza, e quindi essenzialmente cellule di tipo monocito-macrofagico. Queste cellule sono quindi le prime cellule del sistema immunitario che il virus incontra. Per poter dar luogo ad un infezione efficiente il virus che media questa trasmissione è un virus di tipo R5 che deve essere in grado di legare il corecettore ccr5 espresso sulle cellule di tipo monocito-macrofagico.

Gli R5 sono virus importantissimi perché sono quelli che mantengono alto il pool di virus, quindi la viremia. Questi virus infettano molto bene le cellule appartenenti alla linea monocita-macrofagica; nel corso dell'infezione i macrofagi infettati producono una progenie di virus R5, ma anche virus di tipo X4. Il virus, infatti, può mutare e dar luogo ad una progenie di tipo X4. Quest’ultima tipologia infetta bene i Ly T cd4 ed è particolarmente citopatica per queste cellule. I virus X4 sono altamente citopatici per i Ly T cd4, e nonostante ci sia un numero limitato di questi linfociti in periferia, si hanno comunque delle cariche di viremia molto elevate, perchè, pur essendoci deplezione di Ly T cd4, questi virus replicano all’interno dei macrofagi. I macrofagi rappresentano, infatti, una sorta di riserva all'interno della quale il virus continua a replicare in maniera persistente. Questi macrofagi forniscono sempre, poiché il virus è soggetto a mutazioni, nuovi virioni di tipo X4, in grado di infettare nuovi Ly T cd4.

A questo punto ci si può porre un’altra domanda: se i Ly T cd4 sono sensibili all'effetto citopatico del virus, perché non lo sono anche i macrofagi? Perché i Ly T cd4 muoiono a differenza dei macrofagi? La risposta per questo fenomeno è stata acquisita intorno al 2000. La ragione è che il macrofago, quando viene infettato, produce un fattore di crescita che in qualche maniera lo protegge dall'effetto citopatico del virus. Questo fattore di crescita è un fattore particolare che non si pensava potesse essere prodotto da una cellula della risposta immune, poiché è una citochina non classicamente immunologica; essa è una citochina NGF (nerve growth factor). Questa molecola viene prodotta nel momento in cui i macrofagi vengono infettati, e dopo che è stata rilasciata ha un effetto autocrino-paracrino sulle cellule macrofagiche rendendole maggiormente resistenti all’effetto citopatico del virus. Se noi somministriamo, in una coltura in vitro di macrofagi infettati da HIV, anticorpi anti-NGF in grado di neutralizzare questa citochina, i macrofagi muoiono per effetto citopatico del virus.

Riepilogando: i virus che mediano la trasmissione virale in soggetti naif sono quelli di tipo R5. La progenie di virus X4 emerge negli anni, a partire da macrofagi infettati da virus di tipo R5; la progenie di virus X4 è quella associata ad un maggior effetto citopatico nei confronti dei Ly T cd4 e a stadi di immunodeficienza. I macrofagi svolgono un ruolo chiave nella patogenesi perché permettono la continua produzione di nuovi virus, essendo essi stessi resistenti all'effetto citopatico del virus. I macrofagi consentono, quindi, una riserva di virus a differenza delle infezioni di Ly T cd4 che, una volta infettati, per effetto citopatico, muoiono sia loro che i virus stessi; i macrofagi sono una nicchia all’interno della quale il virus può continuamente replicare e sono allo stesso tempo resistenti all’effetto citopatico del virus.

Se negli anni si verifica la produzione di una progenie prevalentemente di tipo X4, come possono questi virus infettare altri macrofagi e mantenere alta la carica virale? I macrofagi possono essere infettati con i virus R5 rimanenti, ma soprattutto possono essere infettati anche dai virus X4. I macrofagi infatti, quando vengono attivati da ligandi microbici, esprimono il recettore cxcr4, che non viene mai espresso su macrofagi non attivati. Si può delineare, quindi, un vero e proprio circuito nel corso dell’infezione da HIV. La prima fase è la trasmissione a livello delle mucose di virus R5 che infettano cellule della linea monocita-macrofagica mantenendo un’alta carica virale.  I virus R5 possono infettare anche i Ly T cd4 e non soltanto i macrofagi. I Ly Th1 ed i Ly Th2 possono distinguersi non soltanto sulla base delle citochine prodotte ma anche sulla base dell'espressione preferenziale di alcuni recettori per le chemochine. In particolare i Ly Th1 esprimono prevalentemente il recettore ccr5, mentre i Th2 esprimono preferenzialmente il recettore ccr3. Le prime fasi dell'infezione sono mediate da R5, che infetta il macrofago. Il macrofago, nel corso della sua presentazione antigenica, può a sua volta infettare con la sua stessa progenie virale Ly T ccr5 positivi, che sono Ly Th1 antigene specifici. L’effetto citopatico su questi Ly Th1 può anche spiegare perché negli anni si verifica una scomparsa di Ly Th1 con una prevalenza di tipo Th2. Dando luogo nel tempo a questa continua replicazione del virus lentamente emergono nuovi ceppi più aggressivi del virus; questi nuovi ceppi risultano più aggressivi poiché, mentre i virus R5 possono infettare solo alcuni LyT cd4+, i virus X4 li possono infettare tutti, in maniera indiscriminata.

Quando si parla di mutazioni del virus, si parla di alcune regione della gp120 che sono quelle in grado di legare un recettore piuttosto che un altro; sono delle modifiche preferenziali in grado di shiftare la progenie virale verso un fenotipo piuttosto che un altro. E’ chiaro che, essendoci casualità, ci sarà un conseguente processo di selezione, e i fenotipi che si osservano sono proprio quelli selezionati. Un individuo infetto che ha quasi tutte le molecole virali di tipo X4 svilupperà l'AIDS in maniera molto più veloce, perché questi virus sono altamente citopatici e uccideranno tutti i Ly T cd4. L’infezione in questo caso sarà di conseguenza molto più grave; inoltre, essendosi in questo caso verificata deplezione dei Ly T cd4, il virus X4 andrà a replicarsi in quei macrofagi che nel corso della loro attivazione hanno espresso recettori cxcr4, specifici per X4; questi macrofagi si attivano perché, con la scomparsa dei linfociti cd4, aumenta il numero delle infezioni microbiche e di conseguenza aumenterà il contatto macrofago-microbo portando queste cellule ad attivarsi attraverso recettori di tipo toll; in seguito a questa attivazione i macrofagi esprimeranno il recettore cxcr4 e potranno essere infettati anche da virus X4 (oltre che dagli R5 rimanenti).

Un virus X4 uccide, quindi, tutti i Ly T cd4 incondizionatamente e poi infetta tutti i macrofagi che si sono attivati e che hanno espresso recettori di tipo cxcr4. Quindi, in generale, il tropismo dei virus può variare a seconda delle circostanze e degli stimoli, e bisogna conoscere quali sono queste circostanze che permettono la variazione dei recettori di membrana presso la cellula ospite; quindi il concetto è che i virus utilizzano recettori esclusivi, e a seconda delle modalità di espressione di questi recettori sulle cellula ospite, il tropismo virale può variare.

Le infezioni delle cellule gliali (macrofagi del sistema nervoso) sono quelle responsabili dei casi di demenza da AIDS; negli stadi finali più gravi dell'infezione si verifica demenza, che è causata dallo svilupparsi di una risposta infiammatoria determinata dalle cellule gliali infettate. Molte strategie farmacologiche, come abbiamo già visto, sono basate sull’utilizzo di farmaci che inibiscono o il legame con cd4 o il legame con la chemochina; tuttavia questi legami difficilmente si possono inibire attraverso l’utilizzo di anticorpi. Il sito di legame con il cd4 potrebbe essere inibito da anticorpi neutralizzanti, ma questo non è sufficiente in quanto la gp120 muta, e quindi non può essere attaccata efficacemente dagli anticorpi neutralizzanti; inoltre il sito di legame per il recettore della chemochina è un sito nascosto, che viene esposto soltanto in seguito al primo legame tra gp120 e recettore cd4, per cui gli anticorpi non sono in grado di trovarlo. In realtà ci sono degli anticorpi che funzionano in vitro, ma che comportano tuttavia dei problemi oggettivi come la difficoltà dovuta alle frequenti mutazioni; esistono anche anticorpi enhancer che in vitro possono anche comportarsi come anticorpi neutralizzanti, ma che in vivo possono paradossalmente favorire ancora di più l'ingresso del virus nella cellula, in quanto l'ingresso può essere mediato, invece che dal virus stesso, dal frammento Fc della immunoglobulina.

Ci sono degli individui che sono più resistenti all'infezione da HIV. Questi soggetti hanno delle mutazioni, come nel caso di una delezione di 32 bp a carico del corecettore ccr5; questi soggetti non hanno un recettore ccr5 funzionante e sono quindi meno suscettibili alla trasmissione del virus. Questi individui hanno una resistenza all'infezione nel caso in cui questa mutazione è in omozigosi,  mentre sono caratterizzati da una progressione più lenta della malattia nel caso in cui la delezione sia in eterozigosi. Questi individui mutanti per ccr5 non ne risentono a livello fisiologico in quanto i recettori delle chemochine sono molto ridondanti, e quindi esisteranno altri recettori in grado di legare le stesse chemochine. Il sistema recettore-ligando infatti è molto ridondante, ed il reclutamento può essere consentito dall'espressione di recettori alternativi.

 

 

Relazioni tra HIV e TBC.

La ricerca in alcuni casi riesce ad identificare quei processi patogenetici che si verificano nel caso di infezioni multiple, come quella di HIV e tubercolosi. Nel mondo 2 miliardi di persone sono infettate dal micobatterium, 42 milioni sono infettate da HIV, mentre quelle che hanno entrambi le infezioni sono 15 milioni, e di questi 15 milioni, 12 milioni vivono in Africa. Innanzitutto per studiare la patogenesi di queste malattie bisogna comprendere l'ambiente all'interno della quale la malattia si sviluppa. Studiare HIV e tubercolosi in zone industrializzate sarà differente rispetto a prendere in considerazione zone malfamate; questo perché i soggetti presenti in alcune aree geografiche interagiscono con un mondo microbico circostante che è sconosciuto alle popolazioni occidentali. Questo vuol dire che il sistema immunitario in alcune regioni geografiche è sottoposto ad una forte pressione. Tutto ciò comporta che alcuni patogeni possono interagire tra di loro con l'ospite.

 

 

Dire che un soggetto è sottoposto ad una forte pressione del sistema immunitario, a causa del microambiente microbico in cui vive, vuol dire che il virus HIV in quell’ospite avrà molte più possibilità di replicare; questo perché le cellule del sistema immunitario di quell’individuo saranno molto più frequentemente attivate rispetto a quelle di altri individui. Quest’interazione si sviluppa in proporzioni importanti nel caso della coinfezione Hiv/micobatterio. Esistono una serie di meccanismi molecolari che giustificano perché l'infezione da HIV e la sua progressione verso stadi di AIDS conclamato siano favoriti dal micobatterium tubercolosis. Alcuni meccanismi indicano ad esempio che il micobatterium tubercolosis favorisce l'attivazione di NF-Kb. Il micobatterio non può essere facilmente eradicato e la presenza di questo microrganismo favorisce l'attivazione di NF-Kb come stimolo proinfiammatorio. L'attivazione di NF-Kb promuove di per sé la replicazione del virus in macrofagi doppiamente infettati. I due patogeni HIV e micobatterium possono quindi infettare la stessa cellula ospite, il macrofago. Il virus HIV in genere nel macrofago replica lentamente negli anni, ma la presenza del micobatterio nella stessa cellula determina un’amplificazione dei processi replicativi. Questo anche perché la presenza del micobatterio favorisce la costituzione di un microambiente proinfiammatorio, fatto da citochine proinfiammatorie come TNF α e IL-6, che hanno come effetto presso la cellula bersaglio quello di attivare NF-Kb. Un Ly T cd4 o macrofago che viene stimolato da TNF α attiva NF-Kb, che determina la proliferazione e l’attivazione cellulare nel microambiente proinfiammatorio.

Verso il ‘97 venne pubblicato un lavoro nel quale si dimostrava il ruolo dell'attivazione cellulare nella replicazione del virus. Si è visto che dei soggetti malati di tubercolosi e allo stesso tempo HIV positivi, al momento della diagnosi tubercolare, erano caratterizzati da un’alta viremia nel sangue. In seguito a trattamento antibiotico (circa 6 mesi) la carica viremica decresce. Questo indica che la presenza del micobatterio è responsabile dell'aumentata replicazione di HIV, e che nel momento in cui si uccide il micobatterio attraverso una terapia antibiotica, decresce anche la viremia.

Negli anni è stato visto che il micobatterio non soltanto favorisce la replicazione del virus HIV ma favorisce anche l'ingresso del virus nella cellula ospite; questo avviene tramite un incremento del recettore ccr5 sulla cellula ospite. Macrofagi alveolari di pazienti con tubercolosi esprimono in membrana il recettore ccr5; questo avviene perché è presente una situazione di infiammazione locale, cosa che invece viene tenuta a bassi livelli nei casi di soggetti che non presentano alcuna patologia infiammatoria del polmone. Prendendo in considerazione macrofagi infettati dal micobatterium che esprimono ccr5, e macrofagi non infettati che non lo esprimono, e infettando queste due tipologie di macrofagi con HIV,  si verifica un aumento nell’ingresso del virus HIV nella cellula ospite infettata dal micobatterium rispetto a quella non infettata.

Il ccr5 è il maggiore corecettore utilizzato da pazienti affetti da tubercolosi. I siti preferenziali di replicazione virale in soggetti con tubercolosi sono ovviamente i polmoni, ovvero i siti infiammati; nei polmoni, infatti, si producono alte cariche virali e i principali virus presenti a livello dei polmoni nei pazienti tubercolotici sono i virus di tipo R5. Inoltre i Ly T cd4 preferenzialmente espressi nel corso di tubercolosi sono, rispetto a soggetti di controllo, i Ly T cd4 ccr5 positivi. Questo è un dato molto importante poiché nella tubercolosi, oltre a macrofagi che esprimono preferenzialmente ccr5, si avranno virus di tipo R5, e i Ly T cd4 che vengono reclutati sono quelli che esprimono ccr5. I Ly T cd4 ccr5 sono quei Ly T a fenotipo prevalentemente Th1.

Questo ci dice che, se noi abbiamo un macrofago, e il micobatterio lo infetta, quest’infezione fa esprimere un maggior quantitativo di corecettori ccr5 che rendono la cellula maggiormente suscettibile all’infezione del virus; il virus, cosi, è in grado di entrare in maniera molto efficiente nel macrofago; dopo di che il virus replica, e nel corso di una presentazione antigenica con Ly T cd4 specifici per il micobatterio, i Ly T cd4 ccr5 positivi, che sono quelli maggiormente reclutati nei polmoni nel corso di un infezione da micobatterio, vengono a loro volta infettati dal virus, e per effetto citopatico muoiono, dando luogo a dei buchi clonali di riconoscimento antigenico per antigeni micobatterici. Questo comporta che nel tempo il soggetto svilupperà forme di tubercolosi più gravi. Riepilogando: a livello dei polmoni un macrofago infettato da HIV che produce progenie virale di tipo R5 può nel tempo produrre anche X4, ma nel periodo in cui produce virus di tipo R5, questi virus infettano Ly T cd4 suscettibili all’azione di R5, che sono appunto quelli che esprimono recettori ccr5. I virus X4, quando vengono espressi, sono virus maggiormente citopatici poiché i recettori a cui esso si lega, i cxcr4, sono espressi su tutti i Ly T cd4, a differenza dei virus R5. Il virus X4 ha, quindi, un effetto citopatico su tutti i Ly T cd4.

 

Nel corso di tubercolosi le cellule cd4 preferenzialmente reclutate nel polmone sono quelle ccr5 positive. Questo perché, trattandosi di un processo infiammatorio, e considerando che i recettori per le chemochine sono fondamentali per guidare la migrazione delle cellule nel tessuto infiammato, nel

caso del polmone il recettore ccr5 può essere considerato un recettore di homing polmonare; questo termine indica che delle cellule esprimono non soltanto dei recettori tessuto specifici, ma anche malattia specifici: infatti nel corso di tubercolosi dove la risposta Th1 è efficace, vengono preferenzialmente reclutati Ly T cd4 ccr5 positivi, perché sono quei Ly T che hanno un fenotipo prevalentemente Th1; i Th1 sono quei linfociti antigene specifici che promuovono, nel caso di infezione da micobatterio, una risposta cellulo-mediata protettiva nei confronti del micobatterio.

In altre parole questo vuol dire che le cellule infettate nel corso di tubercolosi produrranno preferenzialmente chemochine di tipo rantes, mi α, mi1 β,  ovvero quei ligandi specifici per ccr5.

L'accumulo nel polmone di Ly T cd4 ccr5 positivi non dipende, quindi, da una replicazione in situ. ma dipende da un aumento di reclutamento cellulare che è selettivo nei confronti di quei cloni cellulari ccr5 positivi. Quindi verranno reclutati preferenzialmente Ly T cd4 ccr5 positivi di tipo Th1, che a loro volta, nel caso di una coinfezione con HIV, verranno infettati e uccisi per effetto citopatico dal virus. I meccanismi patogenetici che portano alla distruzione di questi linfociti nel polmone prevedono, per esempio, la formazione di sincizi, con cui il legame gp120 tra Ly T infettati da HIV e recettori cd4 di Ly T non infettati, porta alla morte di entrambe le tipologie di cellule per apoptosi. Esistono anche meccanismi in cui le gp120 fanno cross linking con recettori cd4 di altre cellule, che quando ricevono stimoli antigenici vanno incontro ad apoptosi. In questa maniera una cellula diventa prona alla morte cellulare per apoptosi quando riceve uno stimolo antigenico.

La scomparsa, a livello dei polmoni, dei Ly ccr5 positivi di tipo Th1 specifici per il micobatterio, porta a forme di tubercolosi più gravi, perché con la loro scomparsa decade anche il sistema di protezione di tipo cellulo-mediato nei confronti del micobatterio. In questo modo il calo di questi linfociti comporta una minore capacità dell’ospite di contenere la replicazione micobatterica.

Il peggioramento dei sintomi in pazienti tubercolotici affetti da HIV, dovuto a deplezione di Ly T ccr5 positivi nel polmone, porta ad un minor controllo del patogeno e ad una disseminazione ematogena del micobatterio, con cui quest’ultimo è in grado di disseminarsi e di formare tanti piccoli granulomi che occupano l’intero parenchima polmonare e sono responsabili di quelle che vengono definite forme di tubercolosi miliare.

 

Patologia

HIV-TBC e trapianti                                                                                         Lezione 7 del 03.12.07

 

HIV-TBC.

Abbiamo visto come c'è una specie di cross talk tra i due patogeni (MTB e HIV) che hanno come elemento in comune quello di usare la stessa cellule ospite per replicare, e come all'interno di questo cross talk si riusce ad avere un aumento della replicazione virale. Abbiamo anche visto come il micobatterio riesce a favorire sia la replicazione del virus, sia la suscettibilità all'infezione del virus, cosa che comporta la delezione di quei Ly T cd4 specifici per il micobatterio. Questo buco favorisce quindi l'insorgenza della tubercolosi. Nel momento in cui c'è un calo nella frequenza dei Ly T helper antigene specifici, vuol dire che manca quella componente in grado di attivare il macrofago ed in grado di renderlo micobattericida. Un macrofago infettato aumenta la sua attività microbicida tramite le citochine prodotte dai Ly T helper 1 antigene specifici ma, se c'è un calo di questi, il macrofago diventa meno battericida permettendo quindi al micobatterio di replicare. Non è un caso che, prendendo delle sezioni istologiche, ci si rende conto che i pazienti con TBC e HIV, rispetto a quelli con solo TBC, sono meno infettivi ma, nonostante questo, hanno maggiori quantità di micobatterio all'interno perché, replicando, le cellule muoiono.

Se vogliamo avere l'idea di come un soggetto doppiamente infettato risponde al MTB e ne vogliamo studiare in vitro la risposta, dobbiamo fare un modello che riflette quello che accade in vivo. Nel modello in vitro il macrofago deve trovarsi ad interfacciarsi con tanti micobatteri e non con pochi. Quando studiamo un'infezione dobbiamo capire in che contesto l'infezione si esplica. Se vogliamo solo studiare la tubercolosi, vedremo come il macrofago risponde all'infezione fatta da pochi micobatteri ma, dato che in realtà molti pazienti con TBC hanno anche l'HIV, in quei soggetti il macrofago si trova ad interfacciarsi con molti micobatteri in assenza dell'aiuto dei Ly Th1. Questo comporta, quindi, la replicazione incontrollata dei micobatteri in modo tale che i macrofagi appena reclutati si dovranno interfacciare con molti micobatteri, portando ad una risposta diversa rispetto alla risposta che essi avrebbero nei confronti di pochi micobatteri. La risposta che le cellule alveolari hanno in soggetti doppiamente infettati è quella di avere un numero più alto di macrofagi apoptotici; si ha una proporzione più alta di apoptosi dei macrofagi rispetto a quelli con sola tubercolosi. In questo caso i macrofagi, piuttosto che attivarsi e produrre citochine infiammatorie, rispondono innescando anche un programma di morte cellulare.

 

Citofluorimetria.

La citofluorimetria è una tecnologia molto usata nei laboratori di analisi. E' una macchina all'interno della quale facciamo passare una sospensione di cellule marcate con anticorpi fluorescenti (segnale di imput). Queste cellule passano all'interno di una camera dove vengono colpite da un raggio laser ad opportuna lunghezza d'onda. Se la cellula è marcata con l'anticorpo in quanto possiede il recettore specifico per esso, questa cellula, a causa del fluorocromo colpito dal laser, emetterà fluorescenza ad una diversa lunghezza d'onda cosa che ci indica se quella cellula possiede o no quel determinato recettore verso il quale il nostro anticorpo è specifico. Possiamo anche mettere nella macchina la possibilità di purificare le cellule che sono caratterizzate da quel particolare fenotipo, mettendo delle cariche così che la popolazione cellulare fletta e si possa raccogliere in una provetta separata. Questo comprende però il fatto che la cellula esprime quel particolare recettore che emetterà una fluorescenza a causa del fluorocromo legato all'anticorpo.

Il citofluorimetro è potente in quanto permette di studiare e monitorare le popolazioni cellulari, analizzando l'espressione anche di più marcatori simultaneamente. Se abbiamo una cellula che possiede antigene 1, 2, 3 e 4 ed abbiamo anticorpi specifici contro questi antigeni, se mettiamo i nostri anticorpi a contatto con la nostra popolazione cellulare, possiamo avere dei pannelli in cui mettiamo le diverse fluorescenze, con tanti puntini dove abbiamo cellule positive per il marcatore che emette, ad esempio, fluorescenza per 1 ma non per 2. Se abbiamo tante cellule vicine, possiamo disegnare una regione e vedere tra queste cellule quelle che sono anche positive per il terzo e quarto antigene. All'interno di questa regione potremo avere quindi quelle fluorescenti anche ad altri antigeni.

L'autofluorescenza indica che la macchina registra anche emissioni di fluorescenza che la cellula fa a causa della presenza di molecole caratterizzate da doppi legami coniugati che emettono fluorescenza. L'intensità sarà comunque minore rispetto a quella che possiamo ottenere per un fluorocromo per il quale il laser è specifico. In queste analisi stiamo parlando di cellule primarie che sono cellule che vengono prelevate da un soggetto sano e messe in coltura per essere studiate, esse sono comunque diverse tra loro e non perfettamente identiche, per questo abbiamo diversi puntini discostati tra loro. Le linee tumorali sono cellule dotate di crescita indefinita ma anche loro non sono tutte identiche in quanto possono stare in fasi diverse del ciclo e quindi non sono tutte uguali.  C'è quindi un gradiente, e questa è una caratteristica del citofluorimetro che ci permette non solo di vedere la presenza o l'assenza di quel determinato antigene, ma anche di vedere se alcuni recettori sono down regolati, dato che diminuire l'espressione di un determinato recettore ha un effetto biologico. Quando studiamo una cellula non dobbiamo solo vedere se il recettore c'è o no, ma dobbiamo anche vedere se esso è down regolato come risposta della cellula a qualche stimolo che riceve. Esso ci permette di studiare popolazioni cellulari e di caratterizzarle permettendoci di capire se una patologia è associata all'incremento di una particolare popolazione rispetto ad un'altra.

Nel caso dell'HIV esistono dei reagenti per quantificare i Ly antigene specifici che ci permettono di studiare la risposta nel tempo vedendo se la risposta cala, aumenta o rimane la stessa. Di comune uso clinico è la quantità di Ly T cd4 che può essere vista tramite citofluorimetria, nella quale facciamo passare le cellule mononucleate del sangue periferico, ovvero i monociti, i Ly e le NK (NON leucociti che sono polimorfonucleati) e vediamo quindi le diverse quantità di Ly T cd4: se il soggetto è in AIDS vedremo pochissimi Ly dato che l'anticorpo non si legherà al cd4.

Apoptosi mediata dal micobatterio.

L'annessina 5 è una molecola in grado di legarsi alle molecole di fosfatidilserina. Nel corso dell'apoptosi, le molecole di fosfatidilserina, che normalmente sono presenti nello strato interno della MP, si distribuiscono anche all'esterno. Queste molecole di fosfatidilserina possono quindi essere visualizzate tramite marcatura di una annessina 5 coniugata con un fluorocromo per vedere la fluorescenza. Il risultato ci rileva che quella cellula sta andando incontro ad apoptosi.

Aumentando la quantità di batteri per cellula aumenta il numero di cellule che muoiono per apoptosi. Quel processo è veloce e viene immediatamente innescato: già dopo un'ora che esponiamo i macrofagi a tanti micobatteri, queste cellule danno una risposta di tipo apoptotico. Questa risposta per apoptosi avviene perché il micobatterio replica o perché il micobatterio tocca qualche recettore che poi induce apoptosi? Il processo di apoptosi è un processo indipendente dalla fagocitosi e quindi deve essere mediato da qualche recettore di membrana. Se è mediato da qualche recettore di membrana vuol dire che è coinvolto con qualche ligando sulla parete del batterio. Il ligando è una lipoproteina di 19KDa del micobatterio che reagisce con un recettore toll di tipo 2. Se noi trattiamo le nostre cellule con l'anticorpo anti-toll che maschera il sito di legame con il batterio, avremo un dimezzamento della risposta.

Parte di quelle cellule che andranno in apoptosi ci vanno perché il segnale mediato dai recettori di tipo toll induce apoptosi. I recettori toll riconoscono profili molecolari conservati del mondo micobatterico. Essi mediano i primi segnali proinfiammatori che si instaurano. I segnali mediati dai recettori di tipo toll possono indurre non solo infiammazione, ma anche, in alcune circostanze, apoptosi. Questo accade quando la cellula si trova a confrontarsi con un gran numero di micobatteri (o batteri in genere come salmonella, shigella, legionella...).

Le cellule della risposta innata, nel momento in cui si confrontano con un numero di patogeni elevato, si rendono conto che non ce la fanno a controllare quella carica batterica e decidono di morire tramite apoptosi. Il fine ultimo è quello di eliminare una nicchia cellulare all'interno della quale il patogeno potrebbe replicarsi. Il secondo fine è quello di morire per apoptosi tramite una modalità di morte cellulare peculiare, collegata alla produzione di segnali infiammatori (cosa inusuale per una apoptosi). Si inviano quindi contemporaneamente alla morte, segnali proinfiammatori. Questi segnali proinfiammatori sono quelli mediati da TNF α come si vede nell'analisi del citofluorimetro. Possiamo quindi monitorare la produzione di TNF α su cellule apoptotiche. Una cellula che muore per apoptosi tramite questo genere di morte cellulare, attiva il programma di morte ma contemporaneamente produce TNF α. La popolazione di cellule che ha incontrato il micobatterio comincia a produrre citochine. Questo significa che in alcune circostanze, in seguito ad infezioni micobatteriche, i segnali di apoptosi e di infiammazione possono sovrapporsi nella stessa cellula. Una cellula che vede tanti batteri percepisce questo stimolo grazie al legame tra i ligandi batterici ed i suoi PRR, nello specifico i recettori toll di membrana; il macrofago riesce quindi a percepire sia la qualità che la quantità dello stimolo. Esso può pertanto decidere di morire per apoptosi mandando segnali al fine di ricevere aiuto da altre cellule del sangue periferico. Inviare segnali proinfiammatori vuol dire guadagnare tempo, ovvero si cerca di reclutare più cellule possibili in quanto inviando segnali proinfiammatori, si favorisce la dilatazione e la permeabilità dei vasi così che le cellule comincino ad intervenire. Se però non c'è il Ly Th1 che attiva i macrofagi e li rende maggiormente microbicidi, i batteri possono replicare e aumentare di numero, aggravando la situazione. In certi casi possiamo avere anche infezioni di quelle cellule che sono responsabili della fagocitosi dei corpi apoptotici che, se non vengono fagocitati, causano necrosi secondaria aumentando il danno tissutale.

Nel momento in cui abbiamo tanti micobatteri, questo può essere avvertito dalla cellula tramite i recettori toll i quali possono inviare segnali di apoptosi associati a segnali proinfiammatori. C'è un livello soglia oltre il quale i toll attivati inducono apoptosi oltre che infiammazione. L'apoptosi coinvolge alcune caspasi che sono contemporaneamente coinvolte in apoptosi ed  infiammazione, come la caspasi 1che è un tipo di caspasi coinvolta nella maturazione di interleuchina 1 β ma che, in alcune circostanze, può favore l'apoptosi attivando caspasi a valle.

Quindi, se ci sono tanti batteri, la cellula avverte ciò e manda citochine infiammatorie che vengono secrete come TNF α. TNF α, sui Ly infettati con HIV, favorisce di nuovo la replicazione del virus in quanto il TNF α favorisce l'attivazione di NF-kB. In questo caso, quindi, la cellula va in apoptosi, il virus replica, e quello che succede alla fine è che avremo un aumento della replicazione di HIV e la disseminazione del micobatterio in quanto le cellule che contenevano il micobatterio muoiono e si disfano. Ciò che caratterizza questi due processi infettivi è che l'infezione di tubercolosi dissemina dando origine a tubercolosi miliare (tanti piccoli granulomi); il virus intanto replica sia all'interno del macrofago, in quanto vengono prodotte citochine che attivano in maniera autocrina e paracrina altri macrofagi, sia su altri Ly T cd4 dato che vengono prodotte citochine che possono attivare il virus (tramite NF-kB) e sostenerne la replicazione. TNF α può infatti attivare NF-kB nella cellula ospite che a sua volta è un fattore di trascrizione per TNF α stesso, cosa che autosostiene il processo.

 

Trapianti e rigetto.

Quando parliamo di trapianti e rigetto parliamo di:

• Autotrapianto quando una parte di tessuto di un ospite viene trapiantata in un'altra zona dello stesso ospite, come della cute che viene presa da una parte e messa in un'altra, ad esempio nei grandi ustionati. Questo trapianto non viene rigettato.
• Isotrapianto quando trapiantiamo un tessuto da un soggetto, ad un altro geneticamente identico, come nel caso di trapianti tra gemelli monozigoti. Anche questo trapianto non viene rigettato.
• Allotrapianto quando un tessuto viene trapiantato all'interno di un ospite appartenente alla stessa specie ma geneticamente diverso. Questo trapianto viene rigettato.
• Xenotrapianto quando preleviamo un tessuto o organo da un individuo di una specie, inserendolo in un individuo di specie diversa, come nel caso di trapianto tra makako e uomo. Anche questo trapianto viene rigettato.

 

Lo xenotrapianto potrebbe essere usato per sfruttare organi di alcune specie animali per il trapianto nell'uomo. Questo è stato un approccio che è stato affrontato negli ultimi 10 anni ma che adesso è decaduto per una serie di problematiche. Si pensava di usare il cuore di maiale per trapiantarlo nell'uomo dato che esso è simile rispetto a quello dell'uomo da un punto di vita anatomico; sfortunatamente ci sono problematiche di vario tipo, alcune sono quelle del rigetto, ma anche il fatto che esistono dei retrovirus endogeni che possono variare da specie a specie e, quindi, quando portiamo un organo di una specie in un'altra specie, quei retrovirus endogeni potrebbero attivarsi dato che prima si trovavano in un ambiente quiescente che adesso è cambiato.

L'allotrapianto è sempre rigettato. Un allotrapianto secondario (quindi sempre dallo stesso donatore) viene rigettato in maniera più veloce, cosa coerente con quanto abbiamo detto perché la natura del rigetto nei trapianti è derivata dalla risposta immunitaria adattativa (Ly T). Esso risponde proprio alla memoria e alla specificità antigenica, tipici della risposta adattativa.

 

Meccanismo di rigetto.

Il rigetto è il risultato di una reazione infiammatoria che porta alla distruzione del tessuto trapiantato. Gli antigeni di trapianto che fungono da bersaglio del rigetto sono principalmente proteine codificate dall'MHC. Ogni individuo esprime sei alleli MHC di classe  I (un allele per ciascun locus HLA-A, B e C ereditato da ognuno dei due genitori) e almeno sei alleli di MHC di classe II (un allele per ciascun locus HLA-DR, DP e DQ ereditato ognuno dai due genitori, più un numero variabile di combinazioni di tali alleli). I geni MHC sono estremamente polimorfi: è quindi verosimile che ogni individuo esprima alcune proteine MHC estranee per il sistema immunitario di un altro individuo.

Perché abbiamo evoluto un sistema immunitario in grado di riconoscere antigeni non propri di tipo microbico e tumorale ma anche molecole MHC estranee? Alla fine della selezione positiva e negativa dei Ly, verranno selezionati solo quei Ly che riconoscono con bassa affinità i peptidi self presentati dalle MHC proprie: non c'è quindi una ragione evolutiva ma la ragione è casuale, è un prodotto secondario. Questa risposta deriva da una cross reattività che il TCR può avere con molecole MHC eterologhe. Possiamo avere un TCR che riconosce una MHC propria con l'antigene di un certo batterio, ma lo stesso TCR può anche riconoscere la molecola MHC di un soggetto diverso se questa molecola ha, ad esempio, una conformazione analoga a quella che deriva dall'MHC proprio con l'antigene. Le molecole MHC estranee che contengono peptidi allogenici (propri) possono quindi assomigliare strutturalmente alle molecole MHC self contenenti peptidi estranei. Questo tipo di riposta è detta reazione crociata. Solo per omologia conformazionale tra MHC self con peptide estraneo, e MCH non self, possiamo avere questa reazione crociata.

Quando si parla di riconoscimento di un trapianto, pensiamo che venga riconosciuta direttamente la MHC, ma essa non è mai da sola perché ha sempre un peptide associato. Il peptide eterologo può dare un contributo che dipende da quanto la molecola MHC è diversa da quella propria; se è molto diversa, la diversità è tale che il TCR riconosce quella struttura tanto diversa, con un contributo del peptide minimo ai fini della diversità, mentre, se quella molecola di MHC è conformazionalmente simile alla propria, allora il peptide può avere un ruolo importante nel riconoscimento da parte del TCR.

Su questa base possiamo avere due diversi tipi di riconoscimento, quello diretto e quello indiretto:

• Quello diretto deriva da cellule T che riconoscono direttamente le MHC estranee presenti sulle APC del donatore. Se però lavassimo il nostro organo da trapiantare da tutti i leucociti passeggeri che ci stanno, in teoria non dovremmo avere MHC di classe seconda (presenti sulle APC professionali ma anche su cellule endoteliali o sui Ly T attivati) ma avremo lo stesso un rigetto, cosa che implica che i leucociti passeggeri non sono assolutamente necessari per l'induzione di una riposta di rigetto, ma i Ly dell'ospite possono riconoscere anche molecole MHC di classe 1 o 2 delle cellule endoteliali dell'organo da trapiantare.  Questo riconoscimento diretto stimola la formazione di Ly T reattivi, come i CTL, che riconoscono ed attaccano le cellule dell'organo trapiantato.
• Il riconoscimento indiretto si ha invece quando le cellule dell'organo trapiantato vengono fagocitate da APC professionali del ricevente; gli antigeni del donatore vengono quindi processati e presentati nel contesto delle molecole MHC espresse dalle APC del ricevente. Quando vengono riconosciute le MHC proprie legate a peptidi delle cellule trapiantate presentati dalle APC del ricevente, la risposta si esplica dando quindi danno tissutale. L'allo-riconoscimento indiretto si pensa sia quello responsabile del rigetto cronico dei trapianti.

 

Patologia

Rigetto ed autoimmunità                                                                                   Lezione 8 del 05.12.07

 

Componenti effettrici del rigetto.

Gli attori che sono coinvolti in una risposta di rigetto dei trapianti sono quelli della risposta adattativa, quindi anticorpi, Ly T helper e Ly T citotossici, i quali mediano dei meccanismi effettori differenti. Gli alloanticorpi (quegli anticorpi che riconoscono alloantigeni) generalmente svolgono la loro funzione effettrice patogenetica legandosi ad antigeni endoteliali del tessuto che è stato trapiantato. All'interno di questo riconoscimento si può attivare il sistema del complemento e dar luogo a quei meccanismi infiammatori che possono portare a danno tissutale delle cellule endoteliali stesse dando ischemia, trombosi ecc.. I Ly T citotossici, invece, lisano le cellule del parenchima e le cellule endoteliali del tessuto trapiantato quando riconoscono gli alloantigeni di classe 1, mentre le cellule T helper alloreattive riconoscono le molecole MHC di classe 2 mediando l'attivazione ed il sostentamento di una risposta innata e adattativa di tipo citotossico o anticorpale. In alcune specie, come nei roditori, se si eliminano le APC (quelle cellule in grado di esprimere in maniera costitutiva molecole MHC di classe seconda) dal tessuto trapiantato, si è in grado di inibire la reazione di rigetto; questo perché i Ly T cd4, non potendo essere attivati dalle APC allogeniche, non sono in grado di sostenere la risposta sia anticorpale che citotossica. In generale se eliminiamo i leucociti di passaggio, ovvero tutti quei leucociti che stanno lì, la funzionalità dell'organo rimane intatta perché non si va a toccare quella componente cellulare deputata all'attività dell'organo. Questo è vero per i roditori ma non nell'uomo. Nell'uomo infatti le MHC di classe due possono essere espresse anche da altre cellule e non solo dai leucociti passeggeri: anche le cellule endoteliali possono esprimerle, cosa che complica la situazione dando quindi rigetto.

La risposta alloreattiva è la più forte risposta immune conosciuta in natura, se escludiamo quella indotta da mitogeni (molecole fatte a posta per far proliferare le cellule del sistema immune agendo in maniera assolutamente aspecifica). La risposta di rigetto è invece una risposta specifica che possiede memoria immunologica. Nonostante abbia queste due caratteristiche tipiche della risposta adattativa, è la risposta più forte che sia conosciuta. Se un individuo naif ha nei confronti di un antigene che non ha mai visto una frequenza di precursori linfocitari che vanno da 1 su 50k a 1 su 100k Ly specifici per quel determinato antigene, una risposta alloreattiva nei confronti di un particolare determinante antigenico di tipo MHC può variare, nel caso della risposta primaria, da 1 su mille a 1 su 10k, è quindi molto forte, e quando diventa di richiamo quell'1 su mille diventa 1 su 100. Il sistema immunitario non si è evoluto per riconoscere molecole MHC estranee ma la possibilità di avere una risposta che può essere diretta anche contro MHC estranei è dovuta al fatto che esso potrebbe ricordare conformazionalmente altri antigeni non self, in modo tale che avvenga il fenomeno della cross-reattività: alcuni linfociti possono quindi essere cross-reattivi nei confronti di quell'allele MHC perché esso richiama conformazionalmente un antigene microbico nei confronti del quale sono già stati esposti, oppure perché lo stesso allele può presentare una gamma di peptidi self nell'ambito del donatore, che combinati con l'MHC non self, danno una conformazione diversa l'una dall'altra che viene riconosciuta.

 

Tipi di rigetto.

Possiamo distinguere diversi tipi di rigetti in base al tempo di risposta ed in base alle componenti che mediano il rigetto:

• Rigetto iperacuto che può avvenire già nella sala operatoria dopo pochi minuti; in questo caso il tessuto diventa purpureo a causa dalla risposta infiammatoria che viene scatenata immediatamente. Il rigetto iperacuto è mediato generalmente da anticorpi preformati all'interno dell'individuo. L'ospite ha già dentro di sè anticorpi nei confronti di determinati antigeni del trapianto. Questi anticorpi sono preformati e, per potersi sviluppare nell'ambito di minuti, non c'è bisogno che i Ly T e B si attivino, in quanto gli anticorpi sono già presenti. Questi anticorpi immediatamente riconoscono gli antigeni del trapianto legandosi ad essi e scatenando la cascata complementare che può lisare le cellule endoteliali e, con le componenti di anafilotossine (C3A, C4A, C5A), generare una forte risposta infiammatoria. Esse attivano i mastociti. Tutto questo genera danno vascolare, quindi trombosi dei vasi e necrosi ischemica dell'organo trapiantato. Un esempio classico di rigetto iperacuto è quello che si ha nei confronti degli antigeni eritrocitari ABO. Quando si fa una trasfusione bisogna mantenere compatibilità del fenotipo eritrocitario. Gli individui detti gruppo O hanno anticorpi nei confronti di antigeni A e B presenti sugli eritrociti di un donatore A/B, così come quelli del gruppo A hanno anticorpi nei confronti di antigeni B; per questo si fa la tipizzazione del sangue per sapere cosa trasfondere o no. Se uno trasfonde eritrociti di un certo fenotipo, essi possono essere aggrediti dagli anticorpi del ricevente dando emolisi e precipitati che possono occludere i vasi. Per ricapitolare quindi il rigetto iperacuto: è irreversibile; è dovuto ad anticorpi circolanti preformati; è molto raro se non c'è cross-reattività; e risulta nell'attivazione del complemento che da trombosi e danni vascolari, portando infine ad ischemia e rigetto.
• Rigetto acuto che si può sviluppare nell'arco di giorni o settimane. Esso può essere mediato da anticorpi (generalmente IgG), anche questa volta diretti nei confronti di antigeni endoteliali, ma può anche essere mediato da cellule cd4 e cd8. I Ly T citotossici possono causare un danno diretto nei confronti del trapianto stesso inducendo morte delle cellule parenchimali mentre i Ly T cd4 possono causare danno vascolare.
• Rigetto cronico che si può sviluppare nell'ambito di mesi o anni. Il rigetto cronico ha una patogenesi ancora non chiara perché può insorgere anche dopo diversi mesi se non anni con progressiva perdita della funzione renale. Un'ipotesi è quella che il rigetto cronico possa insorgere in seguito ad un riconoscimento allogenico indiretto, un riconoscimento allogenico che dipende dall'endocitosi di molecole MHC endogeniche, dalla loro processazione e dalla loro esposizione di peptidi nel contesto di MHC proprie. Questo tipo di rigetto può essere dovuto anche a farmaci che possono generare danno cellulare; in questo caso le cellule trapiantate danneggiate possono essere fagocitate e quindi possono essere presentati peptidi nel contesto delle proprio molecole MHC. E' molto difficile prevedere questo tipo di rigetto in quanto le cause che possono innescarlo possono essere multifattoriali (meccanismi immuni e non immuni, tossicità di farmaci, ischemie croniche). Anche lo stesso trattamento con farmaci immunosoppressori può causare danno cellulare, per esempio. Questo rigetto è irreversibile e mediato da anticorpi e cellule T.

 

Prevenzione.

Sapendo da cosa è mediato il rigetto iperacuto, basta mettere a contatto gli anticorpi del ricevente con le cellule del donatore per vedere se si presenta una risposta nei confronti di queste cellule. Per avere una risposta gli anticorpi devono essere già presenti. Il fatto che la risposta allogenica sia una risposta particolarmente potente è cosa negativa per l'attecchimento del trapianto, ma positiva in quanto facile da rilevare in vitro. Per questo, in genere, prima di un trapianto si prendono i Ly del ricevente e si fa una classica MLR (mix linfocite reaction). Mettiamo due popolazioni cellulari insieme e, se la popolazione cellulare del ricevente reagisce in presenza della popolazione cellulare del donatore (generalmente leucociti), vuol dire che si stanno riconoscendo dei determinanti antigenici. Possiamo usare diversi sistemi di lettura, come la proliferazione: prendiamo le cellule del donatore e le irradiamo o fissiamo con nitromicina per bloccare la proliferazione, le mettiamo in contatto con le cellule del ricevente e, se osserviamo proliferazione (dovuta dal ricevente), il trapianto non può essere fatto. Possiamo usare anche citochine, ad esempio vedere se è prodotta IL-2 come risposta.

Anche la trasfusione è una forma di trapianto: nelle trasfusioni si trapiantano, infatti, gli eritrociti da un soggetto ad un altro. Nel caso avvenga un rigetto, esso non sarà mediato dal riconoscimento di molecole MHC (dato che gli eritrociti non hanno MHC nè di prima nè di seconda classe) ma dal riconoscimento di antigeni eritrocitari. I test sono di fatto reazioni linfocitarie miste, ma in genere il risultato che si ottiene da questi esami non dice solo che il ricevente ha proliferato o ha prodotto certe citochine, ma la risposta è più particolare in quanto questi test ci dicono anche la frequenza dei precursori linfocitari che riconoscono determinanti MHC allogenici, ovvero quale è la % dei nostri Ly specifici verso il tessuto che stiamo trapiantando.

Un'altra forma di rigetto è quella che si attua tra l'organo trapiantato e l'ospite, quando si ha una risposta del trapianto nei confronti dell'ospite. Questo avviene, per esempio, a seguito di trapianto di midollo osseo. In seguito a questo trapianto il soggetto ricevente deve essere sottoposto a trattamento con farmaci immunosoppressori per evitare che insorga anche la più piccola risposta nei confronti del trapianto. Nel caso di trapianto di midollo osseo, si pone quindi un duplice problema: non solo bisogna stare attenti a non distruggere le cellule del trapianto (con farmaci immunosoppressori) ma bisogna stare attenti che le cellule del trapianto che derivano da precursori linfocitari del midollo osseo possono loro stessi rispondere alle cellule dell'ospite, distruggendole.

 

Autoimmunità.

Con risposta autoimmune intendiamo una malattia nella quale le cellule dell'individuo si attivano scatenando una risposta contro determinanti antigenici propri (self). Per impedire l'insorgere di malattie autoimmunitarie, il sistema immunitario ha evoluto una tolleranza centrale ed una periferica. La tolleranza centrale è quella caratterizzata dall'eliminazione nei tessuti linfoidi centrali (timo e midollo osseo) di linfociti autoreattivi. L'efficienza di eliminazione non è del 100%, quindi non tutti i Ly autoreattivi vengono eliminati; tramite la tolleranza periferica questi Ly residui autoreattivi possono però essere eliminati.

In generale, un Ly T naif, per potersi attivare, deve riconoscere l'antigene assieme ad un secondo segnale o costimolo dato dalle APC professionali che esprimono questo costimolo solo in presenza di un corretto ambiente infiammatorio, come quello indotto da infezioni batteriche. B7.1 e B7.2 sono quei ligandi, inducibili, espressi sulle membrane delle cellule APC mentre cd28 è il recettore espresso costitutivamente sulla membrana del Ly T naif. Quando l'antigene viene presentato ai Ly T naif, ci possono essere diversi segnali: se l'antigene viene presentato in assenza di B7, il segnale che si invia al Ly T naif è un segnale tollerogenico. La tolleranza centrale è quindi l'eliminazione per apoptosi sia di quei Ly che non riconoscono MHC self ma anche l'eliminazione per apoptosi di quei Ly T che riconoscono il self con alta affinità. Quelli che rimangono sono quindi quei cloni che riconoscono MHC self con bassa affinità.

Con tolleranza periferica si intendono varie cose. Tolleranza periferica è la barriera immunologica, come quella dei siti di immunoprivilegio dove non arrivano le cellule immunitarie, come nel caso degli occhi, del testicolo e del sistema nervoso (per la barriera ematoencefalica). In questi siti i Ly generalmente non arrivano ma, se ci arrivassero, le cellule di questi siti, potendo presentare il ligando di Fas, possono indurre apoptosi nei confronti dei Ly attivati che esprimono Fas recettore. In questo modo possiamo avere delezione dei Ly autoreattivi. Un'altra forma di tolleranza periferica è quella mediata da CTLA-4 che, quando viene espresso, può legare B7 e trasdurre segnali inibitori.

Nella tolleranza periferica possono anche partecipare Ly T regolatori che producono citochine ad attività soppressoria come IL-10 e TGF β. (Per vedere nel dettaglio la tolleranza vedi immunologia)

Nelle malattie da autoimmunità, per qualche ragione non ancora ben nota, questa tolleranza viene persa. L'eziopatogenesi di queste malattie non è infatti nota. Ci sono però una serie di meccanismi che possono partecipare all'insorgenza di una malattia autoimmunitaria. Il problema di una tale patologia non è tanto il fatto che possano esserci cloni linfocitari autoreattivi, ma il fatto che essi devono essere persistentemente attivati; l'attivazione deve essere persistente e deve autosostenersi.

 

Meccanismi di una malattia autoimmune.

I meccanismi di una malattia autoimmune possono comprendere:

• Rilascio di antigeni sequestrati: in seguito ad un'infezione batterica o virale, se ad esempio un virus infetta una cellula ospite, deve usare il meccanismo di trascrizione cellulare a proprio vantaggio. Facendo questo esso può interferire con la trascrizione genica cellulare, dando luogo alla trascrizione e traduzione di antigeni cellulari che normalmente non sono espressi e nei confronti dei quali i Ly T non sono stati educati, dato che in genere non sono espressi. Questi antigeni, detti antigeni sequestrati, normalmente non vengono espressi ma ad un certo punto, per svariate ragioni, possono essere espressi. Queste molecole, una volta prodotte, anche se sono intracellulari, una volta processate vengono espresse insieme alle MHC cellulari.
• Fallimento della soppressione o della delezione;
• Molecular mimicry: La mimesi molecolare si ha nel caso di risposte cross reattive in cui un Ly T attivato specifico per un antigene può riconoscerne anche un altro simile; ad esempio può riconoscere due antigeni che si somigliano ma che sono presenti su cellule diverse (antigene batterico simile ad una molecola self), come nel caso delle heat shock proteins che si trovano sia sui batteri che negli eucarioti. Se un antigene batterico assomiglia ad una antigene self, se ci troviamo nel contesto di un'infezione batterica, questo comporta la produzione di una potente risposta infiammatoria anche nei confronti del somigliante antigene self. La risposta antigene specifica si ha solo quando abbiamo un'infiammazione che da attivazione generalizzata delle cellule del sistema immunitario, ed in particolare di quelle cellule che riconoscono antigeni presenti sul microrganismo, a meno che non ci sia stata una delezione timica di quei cloni linfocitari T che riconoscono gli epitopi di quell'antigene microbico. Nel caso in cui non ci sia stata una delezione timica, l'unica tolleranza è quella periferica, ad esempio quella mediata da B7. B7 però non è espresso sulle cellule macrofagiche immature, ma se B7 è espresso perché c'è un ambiente proinfiammatorio rilevante, allora quel clone potrebbe attivarsi. In alcune situazioni la tolleranza periferica può quindi essere bypassata, come quando un certo antigene viene espresso nel giusto contesto di microrganismi, che sono in grado di indurre una risposta infiammatoria presentando quell'antigene con i giusti segnali. Per ricapitolare: quando incontriamo un antigene espresso in un contesto proinfiammatorio, viene facilitato anche il riconoscimento di altri antigeni cross reattivi nello stesso ambiente infiammatorio, in quanto gli epitopi riconoscibili aumentano a causa di una presentazione antigenica più efficiente.
• Attivazione linfocitaria policlonale: In questo meccanismo, a seguito di un'attivazione linfocitaria policlonale dovuta, ad esempio, da un'infezione, aumentano le possibilità di attivare anche cloni autoreattivi verso antigeni self, seppure non ci sono ancora modelli che lo dimostrino. Si pensa comunque che questo meccanismo possa svolgere un ruolo come concausa insieme ad altri processi. Ad esempio, se prendiamo l'influenza e facciamo un'analisi del sangue, avremo tutti i Ly attivati policlonalmente, cosa normale. Con il tempo, per selezione, questa risposta policlonale diventerà sempre più specifica, ma se questo non avviene potrebbe aumentare indirettamente il numero di Ly autoreattivi.

 

Suscettibilità genetica.

Le malattie autoimmunitarie sono multifattoriali; esse devono autosostenersi dato che tendono a rimanere negli anni. Abbiamo quindi anche una suscettibilità genetica. Ci sono individui che hanno degli aplotipi particolari di molecole MHC; per aplotipo si intendono dei geni sullo stesso segmento cromosomico che tendono a segregare insieme. Possono esserci degli alleli MHC che hanno una particolare efficienza a presentare epitopi derivati da antigeni self in quanto hanno dei residui ancora che sono molto efficienti nel legare epitopi di proteine self. Gli individui che hanno l'aplotipo A1B8DR3 hanno una maggiore probabilità di sviluppare patologie autoimmunitarie. In questo caso specifico pero, questa suscettibilità non dipende tanto dagli alleli che cosegregano, ma da quello che ci sta dentro. Si è visto che questi soggetti A1B8DR3 hanno, all'interno della regione genetica, degli enhancer per il TNF α che fa si che esso venga prodotto maggiormente. TNF α è la citochina proinfiammatoria per eccellenza. L'autoimmunità è sempre legata al concetto di infiammazione, in quanto la risposta infiammatoria deve mantenersi nel tempo.

Esistono modelli animali che sono fondamentali per lo studio delle malattie autoimmunitarie come i modelli genetici. Uno di questi modelli è il ceppo murino MLR/LPR, un ceppo che ha una mutazione che insorge a carico del gene Fas. Questi animali, non avendo il gene Fas, il quale è mutato, sono caratterizzati da una malattia linfoproliferativa in cui i Ly proliferano in maniera irregolare e aumentata. Questi topi hanno linfonodi ingrossati enormemente a causa della alta proliferazione dei Ly. Questa malattia è dovuta al fatto che viene meno il meccanismo di tolleranza periferica mediato da Fas. Questi modelli animali sviluppano, nel corso di settimane, una serie di sintomatologie autoimmunitarie, come la presenza di autoanticorpi contro antigeni autologhi. Questi topi sono il modello per studiare il lupus eritematoso sistemico (LES).

 

 

 

Tipi di malattie autoimmuni.

Possiamo avere diverse malattie autoimmunitarie che possono essere distinte in:

• Organo specifiche. Esse sono quelle malattie in cui la risposta autoimmune è diretta verso antigeni localizzati solo in un determinato organo e non in altri; è una risposta in cui l'antigene che viene riconosciuto è tipico di quel determinato organo, come nel caso della tiroidite di Hashimoto in cui l'antigene self riconosciuto è la tireoglobulina.
• Sistemiche. Esse sono quelle malattie caratterizzate dal possedere anticorpi nei confronti di antigeni ubiquitari. Di solito la diagnosi di presenza di malattie autoimmuni si vede analizzando se esistono anticorpi anti-DNA, un importante marcatore per vedere se in quel soggetto è in atto una malattia autoimmunitaria sistemica come il lupus eritromatoso, caratterizzato da anticorpi anti-DNA, RNA e ribosomi.

 

Trattamenti.

I trattamenti che normalmente vengono usati sono farmaci immunosoppressori tra cui abbiamo la ciclosporina e i suoi derivati che inibiscono la produzione di IL-2, una importante citochina che attiva la risposta T helper. Altri farmaci usati sono i corticosteroidi che agiscono più sul fronte della risposta innata inibendo la risposta infiammatoria (mediata da citochine), che deve essere sostenuta per far si che la malattia autoimmunitaria si sviluppi e cronicizzi. Altri meccanismi sperimentali usano la tolleranza periferica sfruttando CTLA-4, usando cellule T regolatorie, oppure usando anticorpi neutralizzanti anti-cd28; neutralizzando il cd28 si impedisce infatti l'attivazione del Ly T vergine. Queste sono ancora strategie in sperimentazione.

 

Ipotesi sul perpetuarsi della risposta autoimmune.

Un'ipotesi di meccanismo per spiegare il perpetuarsi di una risposta autoimmunitaria potrebbe essere la liberazione di DNA mitocondriale. I mitocondri derivano da un processo di endosimbiosi. I mitocondri hanno sequenze di DNA caratterizzate da motivi di tipo CpG che abbiamo già affrontato nel caso di ligandi dei Toll like receptor, come quelli di tipo 9. Questi recettori Toll sono in grado di legare questi motivi e scatenare una risposta infiammatoria. Questi motivi potrebbero quindi fungere da adiuvanti per la risposta autoimmune. Qualsiasi danno tissutale potrebbe infatti liberare questi motivi così da dare quei segnali proinfiammatori che perpetuano la risposta autoimmune con un processo ciclico continuo: danno, lisi, riconoscimento antigenico e risposta infiammatoria.

 

 

Patologia

 

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