Malattie infettive

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Malattie infettive

ELENCO MALATTIE INFETTIVE E DIFFUSIVE CHE DANNO ORIGINE A PARTICOLARI MISURE DI SANITÀ PUBBLICA (DECRETO MINISTERIALE 15 DICEMBRE 1990)

CLASSE PRIMA: Malattie per le quali si richiede segnalazione immediata o perché soggette al Regolamento sanitario internazionale o perché rivestono particolare interesse: 1) colera; 2) febbre gialla; 3) febbre ricorrente epidemica; 4) febbri emorragiche virali (febbre di Lassa, Marburg, Ebola); 5) peste; 6) poliomielite; 7) tifo esantematico; 8) botulismo; 9) difterite; 10) influenza con isolamento virale; 11) rabbia; 12) tetano; 13) trichinosi.

All’elenco delle malattie di cui sopra, è aggiunta la Malattia di Creutzfeldt- Jakob, la variante della Malattia di Creutzfeldt- Jakob, la Sindrome di Gerstmann- Straussler- Scheinker, l’insonnia familiare letale, ed eventuali sindromi ad esse correlate, come previsto dall’Ordinanza 12 febbraio 2001.

CLASSE SECONDA: Malattie rilevanti perché ad elevata frequenza e/o passibili di interventi di controllo: 14) blenorragia; 15) brucellosi; 16) diarree infettive non da salmonelle; 17) epatite virale A; 18) epatite virale B; 19) epatite virale NANB; 20) epatite virale non specificata; 21) febbre tifoide; 22) legionellosi; 23) leishmaniosi cutanea; 24) leishmaniosi viscerale; 25) leptospirosi; 26) listeriosi;

27) meningite ed encefalite acuta virale; 28) meningite meningococcica; 29) morbillo; 30) parotite; 31) pertosse; 32) rickettsiosi diversa da tifo esantematico; 33) rosolia; 34) salmonellosi non tifoidee; 35) scarlattina; 36) sifilide; 37) tularemia; 38) varicella.

CLASSE TERZA: Malattie per le quali sono richieste particolari documentazioni: 39) AIDS; 40) lebbra; 41) malaria; 42) micobatteriosi non tubercolare; 43) tubercolosi.

CLASSE QUARTA: Malattie per le quali alla segnalazione del singolo caso da parte del medico deve seguire la segnalazione dell'unità sanitaria locale solo quando si verificano focolai epidemici: 44) dermatofitosi (tigna); 45) infezioni, tossinfezioni ed infestazioni di origine alimentare; 46) pediculosi; 47) scabbia.

CLASSE QUINTA: Malattie infettive e diffusive notificate all' Azienda USL e non comprese nelle classi precedenti, zoonosi indicate dal regolamento di polizia veterinaria di cui al decreto del Presidente della Repubblica 8 febbraio 1954, n. 320, e non precedentemente menzionato.

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Tabella delle malattie più frequenti
dovute a microrganismi conosciuti

Patologia	Agente infettante	Incubazione	Trasmissione	Denuncia
A.I.D.S.	H.I.V. 1 e 2	6 mesi / 5-8 anni	rapporti sessuali, trasfusioni, strumenti infetti, transplacentare	obbligatoria
Amebiasi	Entamoeba histolitica	pochi giorni	acqua e alimenti	obbligatoria
Anchilostomiasi	Ancylostoma duodenale Necator americanus	poche settimane molti mesi	larve che penetrano attraverso la cute dei piedi	obbligatoria
Arbovirosi	Arbovirus alfa virus Arbovirus flavo virus	3-8 giorni	insetti vettori	obbligatoria nelle zone endemiche
Ascaridosi	Ascaris lumbricoides	2-8 settimane	via orale	non richiesta
Aspergillosi	Aspergillus fumigatus	pochi giorni	inalazione delle spore	non richiesta
Bartonellosi	Bartonella bacilliforme	3 settimane	puntura di flebotomi	obbligatoria nelle zone endemiche
Botriocefalosi	Diphilobotrium	1-2 mesi	pesce non cotto	obbligatoria
Botulismo	tossine clostridium botulinum	5-10 ore	alimenti contenenti tossine	obbligatoria
Brucellosi	Brucella melitentis, Brucella abortus suis	3-5 giorni 3-5 giorni	via orale; latte e derivati, acqua, vegetali, prodotti abortivi	obbligatoria
Campylobacter	Campylobacter phoetus	3-5 giorni	ingestione alimenti	obbligatoria nei primi anni di vita
Candidosi	Candida albicans	3-5 giorni	endogena o da contagio	non richiesta
Carbonchio	Bacillus Antracis	2-3 giorni	via inalatoria o lesioni cutanee mediante spore	obbligatoria
infezioni da Cimici	Cimex	alcuni giorni	contagio diretto	non richiesta
Cisticercosi	Tenia solium	alcuni giorni	ingestione di larve	obbligatoria
Coccidioidomicosi	Coccidioides immitis	10-30 giorni	inalazione di spore	obbligatoria
Colera	Vibrione	1-5 giorni	acqua e alimenti contaminati	obbligatoria
Congiuntivite da inclusi	Clamidia trachomatis	5-7 giorni	acqua contaminata, contagio sessuale, contagio da parto.	obbligatoria
Coriomeeningite	Arena virus	3-15 giorni	ingestione di alimenti e polveri contaminate	obbligatoria
Coxackiosi	PicoRNA virus	3-10 giorni	via orale e respiratoria	non richiesta
Cytomegalovirosi	Cytomegalovirus	3-12 settimane	via aerea, orale, sessuale, trasfusionale, transplacentare, nei trapiantati, infezione perinatale	non richiesta
Dermatomicosi (tigna)	tricophiton	1-2 settimane	contagio diretto	obbligatoria
Difterite	Corinebacterium	2-7 giorni	interumano	obbligatoria
malattia da Ebola	Ebola-virus	5-20 giorni	contagio interumano e con animali	obbligatoria
malattia da Echo	ECHO (enterovirus)	2-15 giorni	via aerea e orale	obbligatoria per le forme gravi
Encefalomiocardite	PicoRNA-virus	2-3 giorni	via aerea e orale	obbligatoria per le forme gravi
Enterite del neonato	Clostridium perfrigens	0-20 ore	cibi contaminati	obbligatoria
Epatite A	Enterovirus	15-30 giorni	via oro-fecale	obbligatoria
Epatite B	HepaDNA-virus	50-180 giorni	trasfusioni, siringhe infette, ferri chirurgici, lesioni cutanee, rapporti sessuali, via materno-fetale	obbligatoria
Epatite C	Flavi-virus a RNA	20-150 giorni	come per Epatite B	obbligatoria
Epatite Delta	HDV replicante	30 giorni	come per Epatite B	obbligatoria
Eritema migrante	Spirocheta ixodes	1-3 settimane	punture di zecche	non richiesta
Esantema subitum (VI malattia)	Herpes	7-14 giorni	via respiratoria	non richiesta
Enterite da EIEL	Escherichia coli	2 o più giorni	oro-fecale	obbligatoria nel 1° anno di vita
Febbre bottonosa	Rickettsia conori	7-14 giorni	puntura di zecca	obbligatoria
Febbre da pappataci	Buyavirus	3-6 giorni	puntura di flebotomo	non richiesta
Febbre di LASSA	Arenavirus	5-20 giorni	contatto diretto con escreti di roditori	obbligatoria per autorità sanitarie internazionali
Febbre gialla	Arbovirus	3-6 giorni	puntura di zanzare femmine	obbligatoria
Febbre Q	Coxiella burneti	14-18 giorni	contatto diretto con peli, pelle, ingestione di carni, latte e polveri contaminate	obbligatoria
Febbre ricorrente	Borrelia recurrenti	5-15 giorni	puntura di zecche e pidocchi	obbligatoria per l'OMS
Febbre tifoide	Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A-B-C	1-3 settimane	oro-fecale tramite acque contaminate	obbligatoria
Filariasi	Wuchereria bancrofti	3-15 mesi	punture d'insetti	obbligatoria
Giardiasi	Giardia lamblia	5-12 giorni	alimenti contaminati da cisti	non richiesta
Gonorrea	Neisseria gonorrhoeae	2-8 giorni	contatto sessuale	obbligatoria
Granuloma inguinale	Calimmatobacterium	10-50 giorni	contatto sessuale	obbligatoria
Herpes labialis Herpes genitalis	Herper simplex virus 1 Herper simplex virus 2	2-12 giorni	contatto diretto attraverso la saliva o le secrezioni genitali	non richiesta
Herpes zooster (Fuoco di S. Antonio)	Virus Varicella-Zooster	varia	riattivazione endogena o via respiratoria	non richiesta
Idatidosi	Echinococcus granulosus	alcuni mesi o parecchi anni	alimenti contaminati da feci di animali infestati	obbligatoria
Imenolepiasi	Himenolepsis nana	variabile	ingestione di cibi o acqua contaminata	obbligatoria
Lebbra	Mycobacterium laprae	3-5 anni	contagio interumano diretto	obbligatoria
Legionellosi	Legionella pneumophila	5-66 ore	goccioline di acqua contaminata	obbligatoria
Leishmaniosi	Leishmania Donovani, infantum, tropica	1-2 mesi	puntura delle femmine di flebotomo	obbligatoria
Leptospirosi	Leptospira interrogans	3-20 giorni	microlesioni cutanee e mucose	obbligatoria
Linfogranuloma venereo	Clamydia trachomatis	7-12 giorni	contatto sessuale	obbligatoria
Listeriosi	Listeria monocytogenes	4-20 giorni	inalazione di polveri e acque contaminate; via transplacentare	non richiesta
Malaria	Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae	15-20 giorni 7-14 giorni 3-5 settimane	puntura di zanzara anopheles femmina	obbligatoria
Megaloeritema (V malattia)	Parvovirus B19	5-15 giorni	via respiratoria	non richiesta
Meningococciemia	Neisseria meningitidis	1-3 giorni	interumana diretta	obbligatoria
Mycoplasmosi	Mycoplasma pnumoniae, hominis, urealiticum	2-3 settimane	interumana e via sessuale	non richiesta
Mononucleosi	Epstein-Barr virus	4-7 settimane	interumana diretta	obbligatoria
Morbillo	Paramixovirus	8-14 giorni	via respiratoria e congiuntivale	obbligatoria
Morva	Pseudomonas mallei	3-5 giorni	microlesioni cutanee	obbligatoria
Ossiuriasi	Enterobius vermicularis	20-30 giorni	via digestiva	non richiesta
Parotite epidemica	Paramixovirus	12-24 giorni	interumana diretta	obbligatoria
Pediculosi	Pediculus capitis, corporis	1 settimana	contagio diretto	obbligatoria
Pertosse	Bordetella pertussis	7-10 giorni	interumana diretta	obbligatoria
Peste	Yersinia pestis	2-12 giorni	puntura di insetti vettori	obbligatoria anche all'OMS
Poliomielite	Poliovirus 1-2-3	20 giorni	via oro-fecale	obbligatoria anche all'OMS
Psittacosi	Clamydia psittaci	1-3 settimane	goccioline di volatili malati	obbligatoria
Rabbia	Lyssavirus	3-6 settimane	morso di animali infetti	obbligatoria anche per gli animali non sospetti
Rickettsiosi	Rickettsia	7-14 giorni	puntura di acaro	obbligatoria
Rosolia	Rubivirus	12-21 giorni	rinofaringea e congiuntivale; via transplacentare	obbligatoria
malattia da Rotavirus	Rotavirus	2-3 giorni	via oro-fecale	obbligatoria nel 1° anno di vita
Salmonellosi	Enterobacteriaceae	8-24 ore	ingestione di carni e alimenti inquinati da feci infette	obbligatoria
Scabbia	Sarcoptes scabiei	1 mese	interumano diretto	obbligatoria
Scarlattina	Streptococco ß-emolitico A	2-5 giorni	via respiratoria	obbligatoria
Schistosomiasi	Trematodi	1-2 mesi	contatto con acque e terreni contaminati	obbligatoria
Shigellosi dissenteria bacillare	Shigella	2-3 giorni	via oro-fecale	obbligatoria
Sifilide	Treponema pallidum	10-90 giorni	contatto interumano diretto; via transplacentare	obbligatoria
Stafilococcosi	Stafilococco aureo	variabile	contatto interumano	obbligatoria per le gastroenteriti del lattante
Streptococcosi	Streptococco ß-emolitico A	variabile	via aerea diretta	obbligatoria solo per la scarlattina
Teniasi	Tenia solium e saginata	8-14 settimane	ingestione di carne poco cotta bovina e suina contaminata	obbligatoria
Tetano	Clostridium tetani	9-20 giorni	ferite cutanee o mucose contaminate da polveri, spine o metalli	obbligatoria
Tifo esantematico	Rickettsia	7-14 giorni	puntura di pidocchio	obbligatoria anche per l'OMS
Tifo murino	Rickettsia	7-20 giorni	puntura della pulce del ratto	obbligatoria
Tossinfezione da cereus	Bacillus cerei	8-16 ore	ingestione di alimenti contaminati dalla tossina	obbligatoria
Tossinfezione da Clostridium	Clostridium perfrigens	8-12 ore	cibi contaminati	obbligatoria
Toxoplasmosi	toxoplasma gondii	5-20 giorni	carni crude, alimenti contaminati, trapianti di organi, via transplacentare	obbligatoria
Tracoma	Clamydia trachomatis	5-12 giorni	contagio interumano	obbligatoria
Trichinosi	Trichinella spiralis	1-40 giorni	carne di maiale con larve	obbligatoria
Trichomoniasi	Trichomonas vaginalis	4-20 giorni	contagio diretto o con acqua contaminata	non richiesta
Tripanosomiasi	Tripanosoma gambiense	2-10 giorni	puntura di ditteri ematofagi	non richiesta
Tsu-Tsu gamushi	Rickettsia	6-12 giorni	larva di acaro	obbligatoria
Tubercolosi	Mycobacterium tuberculosis	4-12 settimane	contagio interumano diretto	obbligatoria
Tularemia	Pasteurella tularensis	2-10 giorni	puntura di insetti o morso di animali infetti	obbligatoria
Ulcera venerea molle	Aemophilus ducrey	2-14 giorni	rapporti sessuali	obbligatoria
Vaiolo	Poxvirus	12-14 giorni	contagio interumano diretto	obbligatoria anche per l'OMS
Varicella	Virus Varicella-Zooster	10-21 giorni	via respiratoria diretta, trasfusioni di sangue, via materno-fetale	obbligatoria
Yersinia	Yersinia	3-7 giorni	contagio diretto	obbligatoria nel 1° anno di vita

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Università degli studi di Catanzaro “Magna Græcia”

Corso di Laurea in Scienze e tecnologie delle Produzioni Animali

DIAGNOSTICA DI LABORATORIO

DELLE MALATTIE INFETTIVE

1. OSSERVAZIONE E STUDIO DEI MICRORGANISMI

- Esame microscopico -

L’osservazione dei microrganismi in laboratorio si avvale oggi di importanti strumenti quali i microscopi. La scelta del microscopio varia in relazione al suo potere di risoluzione e, in alcuni casi, anche in relazione ai costi. Il potere di risoluzione è dato dalla distanza minima tra due punti che ancora si vedono separati e dipende dalla lunghezza d’onda utilizzata. Il potere di risoluzione medio dell’occhio umano è di 0,1 mm. I principali microscopi utilizzati sono:

Microscopio ottico: si compone di almeno due lenti, una dell’obiettivo e una dell’oculare. I microscopi più in uso sono dotati di lenti obiettive, intercambiabili mediante rotazione del blocco portante, con potere di ingrandimento pari a 10, 40 e 100 x e con oculari 10 x. Il massimo ingrandimento di un microscopio ottico è dunque pari a 1000 x. Gli obiettivi a elevato ingrandimento sono a immersione in olio, cioè vengono usati portandoli a contatto con una goccia di olio di legno di cedro, disposta sul preparato da osservare.
Microscopio a fluorescenza: la fonte luminosa utilizzata è la luce ultravioletta la cui lunghezza d’onda è pari a circa la metà di quella dei raggi luminosi, per cui si aumenta il limite di risoluzione dello strumento. Poiché la luce ultravioletta non è percepibile dall’occhio umano, questo microscopio consente di visualizzare campioni che sono fluorescenti o per loro caratteristiche naturali oppure perché trattati con coloranti che emettono fluorescenza.
Microscopio elettronico: utilizza un fascio di elettroni al posto della luce e si può raggiungere un potere di risoluzione di oltre 10.000 volte rispetto a quello ottico con un ingrandimento che può raggiungere 1.000.000 x. La messa a fuoco del fascio elettronico viene realizzata con l’impiego di elettromagneti circolari; l’immagine formata non viene vista direttamente ma viene proiettata su uno schermo fluorescente o su una lastra fotografica.

L’esame microscopico può essere praticato a fresco (osservazione diretta dei microrganismi,solitamente in condizioni di vitalità) o su preparati colorati (osservazione dei microrganismi dopo che sono stati essiccati, fissati e colorati).

L’esame a fresco consente di studiare la forma, la disposizione reciproca, le dimensioni, la rifrangenza, la mobilità e la riproduzione dei microbi. Viene sempre compiuto in mezzo liquido: nel caso che il materiale iniziale sia solido o semisolido (colture su agar, essudati densi), esso va stemperato in un liquido (soluzione fisiologica o brodo nutritizio). I preparati a fresco possono essere allestiti in vario modo. I più comuni sono i seguenti:

I. Preparati su vetrini porta-oggetto con copri-oggetto: si depone una goccia del materiale in esame su un vetrino porta-oggetto e si copre con un vetrino copri-oggetto, con la precauzione di evitare la formazione di bolle d'aria.

2. Preparati a goccia pendente su "cella di Koch": si prende una "cella di Koch” (costituita da uno spesso vetrino presentante, generalmente alla faccia superiore, una escavazione emisferica profonda circa 2 mm e larga circa 15 mm) e si spalma con vaselina filante il bordo della depressione circolare, La cella di Koch viene quindi capovolta e fatta aderire con lieve pressione a un vetrino copri-oggetto sul quale è stata preventivamente deposta una goccia della sospensione in esame. Il preparato viene capovolto di nuovo, in modo da presentare superiormente il vetrino copri-oggetto.

3. Preparati a fresco su fondo scuro. La goccia del materiale in esame viene mescolata con una goccia di inchiostro di china e la miscela stesa fra due vetrini. L'osservazione microscopica, eseguita con obiettivo a forte ingrandimento, preferibilmente a secco, mette in evidenza in modo straordirnariamente nitido le immagini bianche dei mi-

crorganismi, che risaltano nettamente sul fondoscuro dell'inchiostro.

4. Preparati a fresco colorati vitalmente. Possono essere allestiti mescolando su un vetrino porta-oggetto una goccia della sospensione batterica da esaminare con una goccia di soluzioni acquose diluite (1 : 1.000 e più) di coloranti scarsamente tossici, quali ad esempio blu di metilene. rosso Congo, rosso neutro. vesuvina.

L’esame su preparati colorati fornisce informazioni assai dettagliate sia sulla morfologia sia sul comportamento di fronte a determinate colorazioni di fondamentale importanza ai fini dell’identificazione del microrganismo. La tecnica di allestimento di questi preparati varia secondo le colorazioni impiegate; tuttavia,in generale prevede l'esecuzione delle seguenti operazioni:

1. distensione. Se il materiale non è liquido esso va come nel caso dei preparati a fresco, sospeso in una goccia di soluzione fisiologica o di brodo Essudati, escreti e frammenti di organo possono essere schiacciati fra due vetrini porta-oggetto che vengono poi separati, facendoli scorrere uno sull'altro. É opportuno che liquidi organici ricchi di cellule (sangue, pus) siano distesi per strisciamento su un vetrino porta-oggetto.

2. essiccamento. Il materiale disteso si lascia essiccare all'aria o a modico calore [passando rapidamente il vetrino col materiale verso l'alto sulla fiamma a gas (becco Bunsen), in modo che si riscaldi blandamente.

3. fissazione. Questa operazione, che assicura tanto l'adesione del materiale al vetrino quanto la stabilità della morfologia microbica, può essere eseguita chimicamente, impiegando liquidi fissatori, o fisicamente passando il vetrino sulla fiamma a gas.

4. Colorazione. Può essere eseguita secondo diversissime modalità, in relazione agli scopi dell'indagine e, comunque, termina col lavaggio in acqua del preparato colorato.

5. Asciugamento. Può essere attuato mediante carta bibula a superficie liscia oppure mediante calore moderato, dopo aver allontanato per sottolineato la maggior parte dell'acqua.

6. Osservazione microscopica. Se si usano obiettivi a immersione è sufficiente deporre sul preparato una goccia di olio di legno di cedro; se l'osservazione si fa con obiettivi a secco o si desidera conservare il preparato, è necessario ricoprirlo con un vetrino copri-oggetto e includerlo in balsamo del Canada.

malattie infettive

Per quanto riguarda le sostanze coloranti, va precisato che normalmente si impiegano colori di gallina, che hanno chimicamente composizione salina, e si distinguono in coloranti acidi e coloranti basici: questa terminologia non va intesa in senso letterale, cioè non si riferisce alla concentrazione idrogenionica delle loro soluzioni, ma al tipo di carica elettrica che possiede la parte colorata della molecola, cioè il gruppo grossolano.

Coloranti acidi o anionici sono quelli che in soluzione ionizzano conferendo alla porzione colorata della molecola carica elettrica negativa, coloranti basici o cationici sono invece quelli che in soluzione ionizzano conferendo alla porzione colorata della molecola carica elettrica positiva. I coloranti acidi (rosso Congo, fucsina acida) hanno quindi affinità tintoriale per i citoplasmi batterici, mentre quelli basici (blu di metilene, violetto di genziana fucsina basica, safranina, cristalvioletto, vesuvina) tendono a fissarsi sulle sostanze nucleari, che sono appunto acide.

Per la colorazione degli schizomiceti sono generalmente impiegati coloranti basici, i quali si prestano bene a colorare il corpo batterico, in quanto, non essendoci un nucleo delimitato e compatto, il citoplasma stesso è ricco di acidi nucleici.

I colori basici di gallina agiscono sulla cellula batterica in modo diverso: alcuni la colorano moderatamente, senza dar luogo a fenomeni di ipercolorazione (es., blu di metilene); altri la colorano intensamente(es., violetto di genziana, fucsina basica). Può capitare, talora, che la sostanza colorante impartisca una colorazione diversa da quella propria. Tale fenomeno si chiama metacromasia e gli elementi che manifestano tale caratteristica si dicono "cromotropi".

Vi sono essenzialmente due modalità di colorazione dei microrganismi, le colorazioni semplici e quelle differenziali.

Le colorazioni semplici prevedono l'impiego di un singolo colorante, e più comunemente il blu di metilene, il cristalvioletto o la fucsina. La maggior parte delle cellule e delle strutture interne si colorano della stessa tinta impiegata; è possibile così stabilire rapidamente la morfologia, dimensione e disposizione reciproca delle cellule batteriche. Il colorante può legarsi alle diverse strutture del batterio, che quindi si colora marcatamente (colorazione positiva), oppure la sostanza, non avendo affinità per i componenti cellulari, circonda semplicemente il microrganismo, per cui questo rimane incolore su un fondo colorato (colorazione negativa).

Le colorazioni differenziali prevedono l’impiego di più di un colorante e d altri reagenti che favoriscono il differenziamento cromatico tra batteri o strutture batteriche a composizione chimica differente.

- Colorazione di Gram -

É possibile separare i batteri in due gruppi, in base alla loro capacità ad assumere e trattenere determinati coloranti. Questo metodo, usato in tutti i laboratori di microbiologia, è stato ideato nel 1884 dal medico danese Hans Christian Gram, che operava all'obitorio di Berlino e che cercava di scoprire una tecnica di colorazione capace di distinguere i batteri responsabili delle patologie polmonari dai nuclei delle cellule dei tessuti infetti. Gram non fu soddisfatto del suo metodo in quanto non tutti i batteri venivano colorati; in effetti quello che egli considerava un difetto risultò poi essere la base della metodica, attualmente in uso, per caratterizzare i batteri.

La procedura impiegata nel lavoro diagnostico corrente prevede le seguenti fasi

1) stesura, essiccamento e fissazione del materiale

2) colorazione con violetto di genziana fenicato di Nicolle per 2-3 min;

3) trattamento con liquido di Lugol (soluzione di iodio-ioduro di potassio) per 2 min,

4) decolorazione con alcool-acetone (4 : 1) per i min;

5) lavaggio con acqua;

6) colorazione di contrasto con fucsina diluita o eosina al 5% per 1 min;

7) lavaggio e asciugamento.

Alla fine del trattamento i microrganismi Gram-positivi risultano colorati in violetto e quelli Gram-negativi in rosso.

Le notevoli differenze costitutive e morfologiche della parete batterica dei Gram-positivi e dei Gram- negativi giustificano il differente comportamemo alla colorazione di Gram.

Una interpretazione molto attendibile indica infatti nella diversità di spessore e di porosità dello strato peptidoglicanico dei Gram-positivi e dei Gram-negativi la causa del fenomeno: la coartazione del materiale mucopeptidico, conseguente alla disidratazione operata dall'alcool, comporterebbe nei Gram-positivi una riduzione del diametro dei pori esistenti tra le microfibrille del peptidoglicano e quindi una minore permeabilità al cristalvioletto, ossia una sua parziale o totale ritenzione. La ritenzione del colorante non si verifica invece nei batteri Gram-negativi, in quanto la porzione mucopeptidica della parete cellulare è più sottile e con pori notevolmente più larghi. Inoltre, l'estrazione delle sostanze lipidiche operata dall'acetone può concorrere, nei Gram-negativi, ove queste sono abbondanti, a un aumento della permeabilità della parete cellulare e quindi a una più facile estrazione del colorante.

- Colorazione di Ziehl-Neelsen -

Serve per identificare quei microrganismi (micobatteri), i quali hanno la proprietà di assumere e trattenere la fucsina resistendo anche al trattamento decolorante operato con acidi minerali e con alcool.

Più precisamente sono previste le seguenti fasi:

1) stesura, essiccamento e fissazione del preparato;

2) colorazione con fucsina fenicata di Ziehl per 5 min, scaldando con la fiamma fino a sviluppo dei primi vapori;

3) lavaggio cori acqua,

4) decolorazione con alcool al 95%, contenente il 3% in volume di HCI concentrato, per 30 sec;

5) lavaggio con acqua;

6) colorazione di contrasto con blu di metilene per 1 min;

7) lavaggio e asciugamento.

I microrganismi acido-resistenti, alla fine del trattamento, conservano la colorazione rossa impartita dalla fucsina; gli altri vengono invece decolorati e assumono il colore blu del colorante di contrasto.

L'acido-resistenza è una caratteristica del bacillo tubercolare. Tale microrganismo (e più genericamente il gruppo dei micobatteri) ha un elevatissimo contenuto lipidico (dal 20 al 40% del peso secco totale e fino al 60% del peso secco della parete cellulare). Di qui la idrofobia del germe e quindi la tendenza alla aggregazione e al galleggiamento, la impermeabilità ai coloranti, la resistenza agli acidi e agli alcali, proprietà queste ultime sfruttate per l'isolamento dei bacilli tubercolari da materiali contaminati.

Fra i lipidi è caratteristica la presenza di vere e proprie cere (che si riscontrano in un solo altro gruppo di microrganismi, i corinebatteri, alcuni dei quali sono appunto acido-resistenti) e di glicolipidi o micosidi.

Anche l'acido -resistenza è da riferire all'alto contenuto di tali sostanze lipidiche e più in particolare a quelle che non vengono estratte dall'alcool o dagli acidi e che sono fortemente legate alla parete cellulare.

Si è visto infatti che, alterando l'integrità della parete cellulare dei micobatteri, oppure estraendo a caldo, con acidi, tali lipidi fortemente legati alla parete cellulare, i micobatteri perdono l'acido-resistenza. In sostanza, si può dire che il trattamento con acido e alcool altera la parete cellulare dei batteri che non sono acido-resistenti e consente così la decolorazione, ossia l'estrazione e l'allontanamento della fucsina dai costituenti che da questa erano stati precedentemente colorati. Al contrario, nei germi acido-resistenti la fucsina, che con l'aiuto del calore è riuscita a fissarsi su alcuni costituenti lipidici meno superficiali, non viene estratta dall'acido e dall'alcool poiché questi non riescono a penetrare attraverso i costituenti lipidici della parete cellulare e a raggiungere così le parti colorate.

- Colorazione delle spore (Schiffer e Fulton) -

Fra le diverse metodiche si può ricordare quella semplice e pratica consigliata da Schifffer e Fulton. La tecnica di esecuzione è la seguente:

1) stesura, essiccamento e fissazione del preparato;

2) colorazione con soluzione acquosa di verde di malachite al 5%, per 30 sec. scaldando fino a sviluppo di vapori;

3) lavaggio con acqua;

4) colorazione di contrasto con soluzione acquosa di safranina allo 0,5%, per 30 sec;

5) lavaggio e asciugamento.

Le spore si presentano di colore verde-azzurro, mentre le forme vegetative hanno colorazione da rosa a bruno.

- Colorazione di Macchiavello -

Il metodo, comunemente usato per colorare Rickettsie e Clamydiæ, comporta le seguenti operazioni:

stesura, essiccamento e fissazione del preparato
colorazione per 5min con soluzione acquosa di fucsina basica allo 0,25%
lavaggio in acqua
decolorazione molto rapida con acido citrico allo 0,5%
lavaggio in acqua
colorazione di contrasto per 30 sec con blu di metilene all’1%
lavaggio e asciugamento.

Le rickettsie e le clamydiæ assumono una tinta rosso porpora su fondo blu.

- Colorazione May – Grunwald – Giemsa -

E’ la colorazione ottimale per uno striscio di sangue e si compone delle seguenti fasi:

Versare sullo striscio di sangue preventivamente disseccato 1 ml di liquido di May-Grunwald e attendere 3 min
Si diluisce il liquido con 2 ml di acqua distillata e si lascia agire per 5 - 6 min.
Si getta via il colorante senza sciacquare
Si copre il vetrino con 3 ml di acqua distillata e si aggiungono 3 gocce di soluzione di Giemsa. Si attende 7 min
Lavaggio con abbondante acqua, meglio sotto il getto di un rubinetto.
Si asciuga con carta da filtro a temperatura ambiente.

Nuclei: Rosso violaceo
Citoplasmi basofili: Blu
Citoplasmi acidofili: Rosso
Granuli azzurrofili delle cellule linfoidi: Porpora
Granuli azzurrofili delle cellule mieloidi: Violetto
Granuli neutrofili: Marrone - bluastro
Granuli eosinofili: Rosa intenso
Granuli basofili: Blu oltremare

2. TECNICHE COLTURALI

La semplicità morfologica della maggior parte dei batteri non ne rende possibile l'identificazione attraverso la semplice osservazione microscopica.

Per la caratterizzazione e classificazione, un microrganismo deve venire isolato e fatto crescere in coltura pura, in modo da avere la presenza esclusiva della singola specie batterica in esame. Tali colture poi vengono usate per definire le caratteristiche biochimiche, immunologiche e patogene, del batterio.

Per poter ottenere una coltura pura si devono applicare particolari tecniche di semina su terreni colturali solidi, operando in condizioni di sterilità: per una corretta indagine batteriologica, è indispensabile evitare di introdurre microrganismi contaminanti provenienti da aria, acqua, mani o altre fonti non sterili, in quanto è poi impossibile distinguerli dai microrganismi che sono effettivamente presenti nel campione; inoltre, i contaminanti crescono più rapidamente dei batteri di interesse medico e, pertanto, nel terreno di coltura, predominerebbero suoli altri. Questo evento, soprattutto in microbiologia clinica, può impedire la giusta diagnosi ed esitare in una terapia non corretta.

Per evitare la contaminazione batterica è necessario limitare il più possibile l'esposizione del campione ad ambienti non sterili, compresa la stessa aria, e ancora evitare il contatto tra il campione e tutti gli oggetti, i materiali e le strutture non sterili. Si utilizzano perciò contenitori sterilizzati (piastre di Petri e provette) che verranno aperte in ambienti altrettanto sterili, e solo in caso di necessità; inoltre gli strumenti per manipolare i batteri (es., l'ansa per le semine) devono essere sterilizzati alla fiamma, prima dell'uso.

Oltre a questi accorgimenti, è necessario, per ottenere colture pure dei batteri che si intendono isolare e studiare, impiegare adatti terreni colturali, che consentano la loro replicazione, unitamente a particolari tecniche di semina, che consentano di fare crescere in colonie distinte rnicrorganismi diversi, eventualmente presenti nel campione biologico. Per questa finalità è indispensabile seminare il materiale su di un terreno colturale solido, cioè agarizzato (es., agar-sangue o agar nutritivo), in modo tale da ottenere la separazione di singoli elementi batterici uno dall'altro, cosicché, moltiplicandosi durante l'incubazione in termostato, possano dare origine a singole colonie isolate; infatti, poiché tutte le cellule di una singola colonia derivano da un unico microrganismo, sono tutte identiche tra loro e rappresentano pertanto una coltura pura. A questo scopo sono state studiate particolari tecniche per seminare i campioni biologici sui terreni colturali solidi. Una di queste prevede la distribuzione del campione, per strisciamento, in un solo quadrante della piastra contenente il terreno successivamente si distribuisce una piccola parte del materiale dal primo al secondo quadrante, dopo avere eliminato per sterilizzazione alla fiamma tutti ì batteri rimasti sull'ansa di trasferimento; si continua con questa tecnica in modo da distribuire il materiale sui 4 quadranti.

In genere, in microbiologia clinica, si impiegano tamponcini sterili per prelevare campioni dalle cavità orali, nasali, dall'occhio, dall'orecchio, dalla vagina, dal retto e gli essudati di ferite o lesioni; le urine, il sangue e altri liquidi organici si prelevano in contenitori o siringhe sterili.

Dopo isolamento dei batteri, sotto forma di colonie isolate, si può effettuare un trasferimento, dei singoli tipi batterici di interesse, in una provetta contenente terreno colturale liquido, in modo di ottenere una coltura pura in grandi quantità, al fine di avere sufficiente materiale da sottoporre alle varie prove biochimiche per la sua identificazione e per l'esecuzione dell'antibiogramma, e, allo stesso tempo, in una provetta contenente un terreno solido, a becco di clarino, per conservare poi a 4 'C il ceppo cresciuto in purezza

3. TECNICHE DI IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI

Crescendo su un adatto terreno solido, la maggior parte dei batteri dà origine ad aggregati visibili denominati colonie. Le caratteristiche di queste colonie (dimensione, forma, pigmentazione, consistenza) forniscono alcune iniziali e importanti indicazioni, utili all'identificazione dei microrganismi. Si procede quindi all'esame morfologico del singolo germe al microscopio, in modo da definirne la forma (coccoide, bastoncellare o spirillare) e le dimensioni, la presenza o meno di strutture particolari (capsula, flagelli, pili, endospore) e, soprattutto, il suo comportamento alle differenti colorazioni.

Poiché i microrganismi differiscono tra loro per la diversa capacità a utilizzare o produrre determinate sostanze, è possibile identificarli, e quindi classificarli, attraverso il rilievo dei prodotti finali o intermedi delle varie reazioni biochimiche di cui sono capaci. Per questo scopo sono state messe a punto ingegnose prove biochimiche che includono, per esempio, il rilievo di prodotti della demolizione di zuccheri diversi o di altri metaboliti quali acidi, alcooli e gas, oppure la valutazione della capacità di crescere in presenza di determinate fonti di carbonio e di energia.

Pertanto, una serie di prove biochimiche condotte sul batterio in esame, ci può fornire una specie di "impronta digitale" che lo identifica infallibilmente.

La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede terreni di coltura sterili e che riproducano le condizioni ambientali in cui si trova il batterio in vivo. I terreni possono essere solidi o liquidi.

La scelta della composizione chimica del terreno dipende dal batterio che si vuole coltivare. In genere si allestiscono terreni complessi contenenti sostanze come peptoni, siero, liquido ascitico, sangue, etc. I terreni di base sono il brodo normale e l’agar normale. Il primo risulta costituito da una soluzione allo 0.5% di peptoni, 0.3% di estratto di carne e che sia isotonica e tamponata a pH 7.

Il secondo è costituito da brodo normale addizionato del 1.5% di agar. Al terreno vengono quindi aggiunti di volta in volta i nutrienti necessari allo sviluppo del batterio. La temperatura deve essere intorno ai 36° C e devono essere presenti ove necessario O2 e CO2.

- terreni liquidi-

Vengono utilizzati se il materiale in esame è sterile cioè se è presente solo un tipo di batterio. Il vantaggio è dato dal fatto che è possibile esaminare una grande quantità di materiale, lo svantaggio è dato dalla necessità di materiale puro.

malattie infettive

La curva di crescita dei batteri si divide in quattro fasi :

fase di latenza : i batteri sintetizzano gli enzimi necessari per la duplicazione
fase di crescita esponenziale : i batteri si moltiplicano fino a quando nell’ambiente è presente cibo a sufficienza
fase di crescita stazionaria : l’accumulo di sostanze nocive che provoca la morte dei batteri è in equilibrio con la quantità di cibo necessaria alla sopravvivenza
morte cellulare : le sostanze nutrienti vengono consumate interamente

La fase esponenziale può essere mantenuta all’infinito se il terreno di coltura viene periodicamente riciclato. Se si allestisce una coltura sincronizzata i batteri si riproducono nello stesso momento e al fase esponenziale è "a gradini". Si può parlare di popolazione vecchia o giovane a seconda che questa sia in fase esponenziale o in fase di morte. In questo caso si fa comunque riferimento non tanto alla popolazione quanto al terreno di coltura.

- terreni solidi -

Vengono utilizzati frequentemente poiché dispongono di un’ampia superficie e permettono l’isolamento di una singola colonia. Un fattore svantaggioso è dato dal fatto che il terreno tende ad essiccarsi.

Quando vengono inoculati sulla superficie di un terreno gelificato i batteri possono produrre una patina o colonie isolate. La patina si forma quando la quantità di batteri è tale da far unire tra loro le varie colonie. Si hanno colonie singole invece quando il numero dei batteri è così piccolo da non permettere l’unione delle colonie tra loro. Le colonie vengono classificate a seconda della morfologia macroscopica in :

colonie S (Smooth= liscio) : sono lisce e cremose
colonie R (Rough= rugoso) : sono secche e rugose

Il passaggio dalle S alle R si ha quando i batteri perdono un componente (capsula in Pneumococchi, lipopolisaccaride nei Gram-), la fase R ha infatti un minor potere patogeno.

Per studiare un batterio specifico è necessario allestire colonie nelle quali sia presente solo il batterio desiderato. Perché ciò sia possibile è necessario utilizzare un terreno solido poiché nei liquidi i vari batteri si mischiano tra loro e non possono essere isolati. I contenitori più utilizzati sono le provette, le piastre ed i matracci (fiaschette troncoconiche). Sono in genere utilizzate maggiormente le piastre data l’ampia superficie disponibile. Le tecniche utilizzate sono la semina per disseminazione in superficie e la semina per diluizione nella massa di terreno solido liquefatto.

Nel primo caso si allestisce una piastra versandovi dell’agar fluidificato che viene lasciato raffreddare. Con la pipetta si versa una goccia del materiale prelevato sulla superficie in prossimità dei margini. Poi con un vetrino sterile si stende il preparato sulla piastra avendo cura di non passare due volte sullo stesso punto. Le colonie più distanti saranno le più isolate.

In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni relative, i terreni di coltura sono classificati come: sintetici (o definiti) e complessi.

- terreni sintetici o definiti -

I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si conosce l’esatta composizione. Vengono quasi sempre preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo che si desidera crescere. Generalmente contengono un numero definito di sostanze a concentrazione nota. Alcuni terreni sono però ben più complessi. Questi tipi di terreno vengono ampiamente utilizzati nella ricerca, dato che spesso si rende necessario conoscere il substrato che viene metabolizzato dal microrganismo che si desidera coltivare.

- terreni complessi -

I terreni complessi sono quei terreni di cui non si conosce in maniera dettagliata la composizione chimica. Questi mezzi di coltura risultano di estrema utilità in quanto permettono di crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro. Inoltre è possibile crescere specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute. Oltre alle sostanze “standard” i terreni complessi contengono:

Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica (questi particolari proteine son parzialmente idrolizzate altrimenti denaturerebbero ad alte temperature);
Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi, peptidi, nucleotidi, acidi organici, vitamine e sali minerali;
Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell’azoto

4. ISOLAMENTO DEI VIRUS

I virus, parassiti intracellulari obbligati, possono moltiplicarsi solo in animali, in embrioni o in colture cellulari in vitro.

L’isolamento di virus a scopo diagnostico è indicato solo quando non è possibile ricorre ad altri mezzi, oppure quando si verificano le seguenti situazioni:

- è presente una malattia ad andamento epidemico che coinvolge molti soggetti dì un allevamento e che non risponde ad alcuna terapia antibiotica;

- è presente una malattia di tipo vescicolare che potrebbe estendersi rapidamente a tutti gli animali dell’allevamento e ad altri allevamenti (sospetto di afta epizootica o stomatite vescicolare);

- c’è il sospetto che sì tratti di una zoonosi (encefaliti equine, rabbia).

Spesso il tentativo di isolamento dà esito negativo: non è corretto escludere immediatamente l’eziologia virale della patologia, in quanto possono essersi verificate diverse situazioni:

- il virus nel campione è presente in bassa concentrazione o ha necessità di adattarsi al substrato. (passaggi “ciechi”: nel prelevare parte della prima coltura, in cui non si sono evidenziati effetti citopatici, - criolisato - centrifugazione per allontanare i detriti cellulari - seminare il materiale in una coltura fresca;

- si è in presenza di un virus che, pur replicandosi, non produce effetto citopatico, o la morte dell’embrione

- il substrato non è sensibile a quel particolare virus;…

- ci possono essere nel campione anticorpi neutralizzanti, inibitori virali, o interferone, che ostacolano la replicazione del virus pur essendo il substrato sensibile;

- l’inoculum è tossico o contaminato da batteri e il substrato ne viene danneggiato, impedendo di conseguenza la replicazione del virus.

- isolato un ceppo vaccinale attenuato, e non un ceppo “selvaggio”; il virus isolato è casualmente presente, ma non è il responsabile della patologia in atto; viceversa, l’ospite è un portatore sano del virus stesso.

- Uova embrionate -

Si utilizzano

uova fertili di pollo, o di altri volatili.

L’uovo embrionato trova impiego sia a scopo diagnostico (isolamento primario di virus da materiale patologico, titolazione dei virus e degli anticorpi specifici), sia per ottenere grandi quantità di virus (allestimento di vaccini, analisi biochimiche). Risulta ancora il metodo più sensibile e pratico per l’isolamento dei virus influenzali aviari e di altri virus dei volatili, nonché per l’identificazione degli Orthopoxvirus.

Anche le uova fecondate, come gli animali da laboratorio e per le stesse ragioni, devono provenire da allevamenti indenni da malattie virali o da infezioni sostenute da altri microrganismi (micoplasmi), devono cioè essere uova SPF.

La particolare struttura dell’uovo embrionato consente l’impiego di diverse tecniche di inoculazione, a seconda delle esigenze del virus che si vuole coltivare.

L’inoculazione viene generalmente eseguita tra il 5° e il 14° giorno di incubazione.

Bisogna controllare che l’embrione sia vitale e si sviluppi regolarmente e a questo scopo si utilizzano speciali lampade “sperauovo” a raggi UV, che consentono di controllare l’integrità dei vasi sanguigni della membrana corion-allantoidea e le dimensioni dell’embrione.

L’

inoculazione sulla membrana corion-allantoidea si effettua su embrioni di 10-12 giorni di età.

Si crea una camera d’aria artificiale alfine di scollare la membrana corion-allantoidea dalla membrana testacea: si perfora il guscio in due punti, uno in corrispondenza della camera d’aria e l’altro nella zona equatoriale dell’uovo.

Mediante una cannula di gomma si opera una aspirazione dal foro aperto in corrispondenza della camera d’aria - entrerà aria dal foro nella zona equatoriale, scollando così le due membrane.

Attraverso questa apertura, vengono depositati 0.1-0,2 ml di sospensione virale direttamente sul corion-allantoide.

Dopo chiusura dei fori con gomma o paraffina, le uova vengono nuovamente poste a incubare per un certo periodo. Quando l’embrione viene a morte sulla membrana corion-allantoidea si osservano le lesioni che appaiono come alterazioni macroscopiche circoscritte (pocks o pustole).

-Colture cellulari-

Lo sviluppo delle tecniche di allestimento di colture cellulari è iniziato con l’avvento degli antibiotici (circa 60 anni fa) che hanno reso possibile il controllo delle contaminazioni da batteri. La crescita batterica, infatti, sottrae materiale nutritivo alle cellule, produce cataboliti tossici, impedisce il metabolismo cellulare e, in definitiva, distrugge la coltura stessa. Per lo stesso motivo, è necessario lavorare in condizioni di sterilità, durante le manualità richieste per l’allestimento e l’utilizzo delle tessuto-colture; tuttavia, l’uso di antibiotici, addizionati al terreno di coltura, rende meno frequenti le contaminazioni stesse.

Da quel momento in poi le colture cellulari hanno consentito di scoprire numerose famiglie virali, di approfondire gli studi sul ciclo replicativo e sulle caratteristiche genetiche dei virus e di interpretare il meccanismo con cui i virus tumorali esprimono la loro funzione oncogena. Inoltre, le colture cellulari rappresentano attualmente un substrato largamente utilizzato per l’allestimento di vaccini.

Con il termine generico di colture di tessuto si intendono cellule, tessuti od organi provenienti da animali e mantenuti o fatti sviluppare in vitro per oltre 24 ore. Più precisamente le colture di tessuto o d’organo sono espianti di tessuto o di frammenti d’organo le cui cellule sono rimaste aggregate, conservando l’architettura e la funzionalità originarie; le colture di cellule, invece, sono ottenute da sospensioni cellulari allestite disgregando meccanicamente o chimicamente i tessuti.

Tra queste, possiamo distinguere: le colture primarie (linee cellulari primarie); le colture semi-continue (linee cellulari diploidi); le colture continue (linee stabilizzate).

Colture primarie (linee cellulari primarie).

Sono quelle colture ottenute direttamente da un organo o da un tessuto, preferibilmente prelevato da un animale molto giovane o da un feto o un embrione: la ragione è che le cellule in questi casi sono meno differenziate e si moltiplicano più facilmente di quelle prelevate da un organismo maturo.

L’organo deve essere privato della capsula connettivale; quindi si frammenta il parenchima della corticale. I singoli frammenti vengono poi sottoposti a trattamento enzimatico immergendoli in una soluzione di tripsina mantenuta a 37°C in agitazione continua. Il liquido diventa gradatamente torbido, arricchendosi in cellule, staccatesi dal frammento e separate fra loro per azione dell’enzima; le cellule vengono recuperate mediante filtrazione su garza sterile, raccolte in un matraccio mantenuto a 40°C e SFB per fermare l’azione della tripsina. A questo punto, ai frammenti rimasti viene aggiunta nuova tripsina, e si ripete l’operazione più volte fino a completa disaggregazione dei frammenti stessi. La sospensione cellulare così ottenuta viene sottoposta a centrifugazione e il pellet viene risospeso in adatto terreno di coltura in modo da ottenere una concentrazione di 8 x 105~106 cellule/mI e distribuito in appositi contenitori (piastre, fiasche, provette, ecc.). I contenitori sono posti a 37 0C in incubatore, umidificato, e in atmosfera di aria contenente il 5% di CO2.

La densità delle cellule nelle colture primarie è un fattore critico per la loro crescita: al di sotto di un certo limite, infatti, le cellule non riescono a moltiplicarsi, verosimilmente perché necessitano di scambi diretti di metaboliti attraverso la membrana, la cui natura è peraltro sconosciuta. Infatti, dopo che le cellule hanno aderito al fondo della piastra, incominciano a moltiplicarsi sino a occupare tutta la superficie disponibile, costituendo in tal modo quello che viene definito monostrato confluente. A questo punto, la moltiplicazione cessa e, se le cellule non vengono sub-coltivate, il monostrato degenera e muore, in un tempo variabile a seconda del tipo cellulare e delle condizioni di crescita. (20-30 passaggi)

Colture continue (linee stabillzzate).

Si tratta di linee cellulari che possono essere coltivate senza limite di numero di passaggi, in quanto hanno subìto una trasformazione che le rende più adatte alla crescita in vitro. Il loro patrimonio cromosomico è, infatti, alterato rispetto al normale, e viene definito genericamente aneuploide (spesso, ma non sempre, e poliploide, cioè invece di essere 2N è, ad esempio, 4N). L’aspetto delle cellule è generalmente di tipo epitelioide: cellule rotondeggianti ma con scarsa tendenza a formare foglietti simil-epiteliali.

Spesso le linee continue sono derivate da tessuti tumorali che, di per sé, sono già alterati rispetto a quelli normali e dotati di una maggiore capacità di crescita in vitro. Infatti, la prima linea cellulare stabilizzata è stata ottenuta, nel 1952, da un carcinoma epidermoide della cervice umana.

Attualmente sono a disposizione di ciascun laboratorio numerosissime linee continue, sia “normali”, sia derivate da tessuti cancerosi dell’uomo e di molte specie animali. Tra queste soprattutto di mammiferi e di volatili

Colture semi-continue (linee cellulari diploidi)

Si tratta di linee cellulari che possono essere mantenute vitali per 30-80 passaggi, senza che subiscano alterazioni del patrimonio genetico diploide, pur verificandosi una certa selezione di cellule diverse a ogni passaggio. In particolare, si sono rivelati molto utili i fibroblasti di embrioni umani, che mantengono la diploidia fino al 500 passaggio. E pertanto possibile congelare un’aliquota di cellule a ogni passaggio, e riutilizzarla quando se ne presenta la necessità, con la certezza di avere ancora la sensibilità desiderata. Infatti il patrimonio cromosomico diploide è una caratteristica molto vantaggiosa quando si vogliano utilizzare le cellule per il primo isolamento dei virus, in quanto rappresentano un substrato molto simile a quello naturale e, quindi, sensibile alla quelli derivati da tumori delle cellule mieloidi o linfoidi, crescono normalmente con questa caratteristica; altri possono essere mantenuti artificialmente in sospensione mediante agitazione dei recipienti. Questo consente di ottenere una maggiore densità cellulare rispetto alle colture in monostrato.

- Identificazione del virus isolato -

Una volta ottenuto l’isolamento del virus, questo deve essere identificato: per raggiungere questo scopo si può ricorrere a tecniche diverse. Si può ricorrere anche in questo caso alla microscopia elettronica: una interessante alternativa alle metodiche descritte in precedenza è la cosiddetta Grid Celi Culture Technique (GCCT) che consiste nel coltivare il virus in colture cellulari allestite direttamente sui retini per elettronmicroscopia. L’osservazione può essere poi condotta dopo semplice colorazione negativa, immunoelettronmicroscopia o altre tecniche. In questo modo è più probabile riuscire a osservare il virus eventualmente isolato, senza dovere ricorrere a procedure di ultracentrifugazione o altre tecniche per ottenerne la concentrazione.

Molto utilizzate sono le tecniche sierologiche, attraverso l’impiego di sieri iperimmuni o anticorpi monoclonali specifici. Il vantaggio dei metodi sierologici è che l’identificazione di un certo isolato può essere portata, se necessario, sino alla definizione del sierotipo. Molto adatta a questo scopo, come nel caso della ricerca diretta degli antigeni virali, è l’immunofluorescenza. Tuttavia nel laboratorio di virologia sono frequentemente impiegate metodiche più “mirate”, quali la inibizione della emoagglutinazione o dell’emoadsorbimento e, soprattutto, la sieroneutralizzazione, per la loro alta specificità nella caratterizzazione dei sierotipi.

In certi casi si può ricorrere alla identificazione di un virus in coltura attraverso la dimostrazione (ed eventualmente la quantificazione) di un suo enzima specifico: ad esempio la trascrittasi inversa nel caso dei retrovirus. Infine, è possibile identificare un isolato ricorrendo alle tecniche molecolari (sonde molecolari e PCR) di cui si è già detto a proposito dell’esame diretto, se il laboratorio è particolarmente attrezzato a questo scopo.

Titolazione dei virus -

In molti casi è necessario conoscere, oltre al tipo di virus isolato, anche la quantità di particelle contenute in una preparazione di virus: infatti alcune delle più utilizzate tecniche sierologiche sono basate proprio sulla valutazione della riduzione della infettività e della capacità agglutinante di una certa quantità di virus in presenza di anticorpi specifici. Inoltre è necessario conoscere il titolo di un virus quando si deve eseguire una infezione sperimentale e, quando si allestiscono vaccini, nei quali la quantità di virus presente è determinante ai fini della successiva protezione dell’animale. Le procedure in uso per la titolazione dei virus si basano sul rilievo di alcune loro caratteristiche fisiche, chimiche o biologiche; di queste ultime la più importante è l’infettività.

Titolazione fisica.

I virioni’ possono essere riconosciuti al microscopio elettronico e contati, mescolandoli con un numero noto di particelle di lattice ed eseguendo un conteggio proporzionale su singole gocce della miscela. Tuttavia non è possibile differenziare in questo modo le particelle infettive da quelle che non lo sono. Inoltre tale tecnica è piuttosto indaginosa e, quindi, di scarso impiego nella pratica.

Titolazione mediante il fenomeno della emoagglutinazione (HA).

La proprietà che alcuni virus possiedono, di agglutinare i globuli rossi di determinate specie animali offre un metodo semplice e di rapida esecuzione per titolare i virus. Sebbene il tipo di globuli rossi che può essere agglutinato e le condizioni alle quali si realizza il fenomeno (temperatura. pH, elettroliti) siano variabili per i diversi virus, il fenomeno è simile in tutti i casi: un virione si unisce contemporaneamente a due globuli rossi e funzionano da ponte tra di loro; con elevate concentrazioni virali si ottengono così degli aggregati formati da un reticolo di eritrociti legati tra loro dalle particelle virali. Sfruttando tale fenomeno è così possibile titolare i virus emoagglutinanti, mediante il metodo della diluizione al punto finale: concentrazioni decrescenti di virus vengono mescolate con una quantità standardizzata di globuli rossi e la più alta diluizione del virus capace di provocare emoagglutinazione evidente viene definita Unità emoagglutinante (UHA). Alla fine, mentre i globuli rossi normali si depositano sul fondo del pozzetto, raccogliendosi nel centro e formando un dischetto con i margini ben definiti, i globuli rossi agglutinati si dispongono in un sottile strato, a margini irregolari, che ricopre tutto il fondo del pozzetto.

Metodo della diluizione limite.

Si tratta di un metodo meno preciso del precedente, in quanto non misura direttamente il numero delle particelle virali, ma si limita a valutare la capacità infettante di una certa diluizione del virus. Tuttavia è considerato sufficientemente attendibile ed è largamente utilizzato nella routine di laboratorio, soprattutto nella sua versione su colture cellulari in micrometodo: è infatti molto più rapido del metodo delle placche (in genere la lettura può essere effettuata entro 48 ore per la maggior parte dei virus, mentre lo sviluppo di placche contabili richiede da 5 giorni sino a 3 settimane di tempo) e di più facile esecuzione. Inoltre è alla base della tecnica di sieroneutralizzazione, utilizzata per la titolazione degli anticorpi specifici anti-virus.

Il virus viene diluito serialmente (in genere in base 10) e un volume costante di ogni diluizione viene inoculato in un numero stabilito di unità biologiche scelte per il test, che possono essere tessuto-colture, embrioni di pollo o animali. Si osserva poi, per ogni diluizione, quante unità hanno risposto all’infezione, che può provocare degenerazione delle tessuto-colture, comparsa dei vari effetti citopatici, morte degli embrioni, morte o malattia degli animali.

Se il test è eseguito correttamente, le concentrazioni più elevate del virus determinano l’infezione di tutte le unità inoculate, mentre quelle meno elevate infettano un numero di unità variabile finendo per non infettarne alcuna.

5. DIAGNOSTICA SIEROLOGICA

L'unione di un antigene con il rispettivo anticorpo può dare origine a una serie di reazioni diverse che possono essere rilevate in vitro.

Poiché in laboratorio la fonte degli anticorpi è rappresentata prevalentemente dal siero di sangue, tali prove vengono genericamente indicate come reazioni sierologiche.

Gli anticorpi si generano a seguito dell'esposizione di un organismo a un antigene e poiché l'unione tra l'anticorpo e l'antigene, che ne ha provocato la produzione, è estremamente sensibile e specifica, le reazioni sierologiche hanno trovato impiego soprattutto in clinica medica, quale supporto diagnostico nei soggetti colpiti da malattie infettive e parassitarie, nonché nelle manifestazioni di ipersensibilità (es., allergie, ecc.) e nelle malattie autoimmuni.

É cioè possibile ottenere importanti informazioni diagnostiche e prognostiche, attraverso il rilievo della presenza, nel siero di sangue di un paziente, di elevate concentrazioni di anticorpi che reagiscono specificamente con una preparazione di laboratorio allestita con il microrganismo sospetto, con suoi antigeni o con suoi prodotti. Titoli anticorpali elevati indicano che il paziente è stato esposto a quel patogeno e che ha risposto immunologicamente. Un titolo anticorpale estremamente elevato, oppure la presenza di un buon titolo di quegli anticorpi che scompaiono rapidamente dopo una malattia, fanno supporre un ruolo attivo del corrispondente microrganismo, che quindi è da ritenere il responsabile della sintomatologia osservata al momento del prelievo.

Il più delle volte, però, la diagnosi sierologica deve essere basata sulla comparsa di una variazione del titolo anticorpale nel corso di una malattia: si esaminano pertanto contemporaneamente due campioni di siero. Il primo, il cosiddetto siero acuto, deve essere prelevato il più precocemente possibile dall'inizio della sintomatologia clinica; il secondo, detto siero convalescente, dopo 2-3 settimane dal precedente. La comparsa di anticorpi prima non rilevabili, oppure un aumento del titolo di almeno 4 volte fra i due campioni di siero, sono da considerare indicativi di infezione recente.

Per eseguire le prove sierologiche è ovviamente necessario disporre di un'adatta fonte di antigene che, come detto, può essere rappresentata dall'intero microrganismo (batterio, virus, protozoo), oppure dai suoi antigeni ottenuti per estrazione. In alcuni casi, con microrganismi patogeni, difficili da coltivare in laboratorio e per i quali quindi non sono disponibili adatte preparazioni antigeniche, è possibile eseguire le prove sierologiche impiegando una sostanza diversa, che abbia però una spiccata similarità antigenica con il patogeno in esame. Si ricorre all’utilizzo di antigeni eterofili, presenti contemporaneamente nei tessuti di individui di specie diverse, nonché su alcuni microrganismi, che reagiscono quindi con lo stesso anticorpo. Per esempio, gli anticorpi prodotti contro il virus che causa la mononucleosi infettiva cross-reagiscono con un antigene presente sugli eritrociti di pecora. Pertanto il rilievo di un titolo elevato di anticorpi che agglutinano i globuli rossi di pecora fornisce una valida diagnosi di mononucleosi infettiva. Allo stesso modo, la diagnosi di rickettsiosi viene effettuata ricercando nel siero del paziente anticorpi capaci di agglutinare certi ceppi di Proteus che presentano un antigene comune alle rickettsie.

In campo veterinario sono da ricordare, nel bovino, cross-reattività degli anticorpi tra gli antigeni di Brucella abortus e gli antigeni di alcuni ceppi di Yersinia enterocolitica; nel gatto, invece, gli anticorpi anti-virus della peritonite infettiva (FIP) cross-reagiscono con il virus della gastroenterite trasmissibile del suino (TGE).

Oltre alla dimostrazione degli anticorpi specifici, presenti nei liquidi organici di un paziente, le reazioni sierologiche vengono anche impiegate per identificare i microrganismi, o direttamente nei tessuti infetti o dopo il loro isolamento in laboratorio. Per tali finalità devono essere disponibili adatti sieri iperimmuni o anticorpi monoclonali, che reagiscano cioè specificamente solo con il patogeno che si sta cercando.

Il tipo di reazione che si può osservare, facendo reagire un antigene con lo specifico anticorpo, dipende soprattutto dallo stato fisico dell'antigene (solubile o particolato) e dalle condizioni sperimentali della prova che si vuole eseguire. Se l'antigene è una proteina solubile, la reazione tra opportune proporzioni di antigene e di anticorpo esita nella formazione di complessi insolubili (precipitazione). Se l'antigene è invece presente sulla superficie di elementi corpuscolati (es., batteri o eritrociti), gli anticorpi formano dei ponti tra diverse particelle, causandone l'agglutinazione.

Nelle reazioni con i globuli rossi se, oltre agli anticorpi anti-eritrociti, viene aggiunto anche il complemento, si determina un'immuno-emolisi specifica.

Le prove sierologiche forniscono anche dati quantitativi sul contenuto in anticorpi, la cui concentrazione può quindi venire espressa come titolo anticorpale, cioè come l'ultima diluizione del siero che ancora provoca la reazione visibile con una concentrazione fissa del corrispondente antigene. Ad esempio, se un siero, usato nella prova a diluizioni scalari per raddoppio (1:10, 1:20, 1:40, ecc.), produce l'aggIutinazione (di un determinato antigene) sino alla diluizione 1 :640, ma non causa più la reazione alla diluizione successiva (1 :1280), si dice che il suo titolo agglutinante è 1:640, o che contiene 640 unità agglutinanti per unità di volume.

Sebbene il rilievo del titolo anticorpale specifico nel siero di un paziente fornisca indicazioni di inestimabile valore applicativo per la diagnosi delle malattie infettive, è opportuno sottolineare che tale dato fornisce un quadro solo parziale dello stato immunitario del soggetto. Le differenti prove sierologiche rilevano infatti tipi di anticorpi diversi, sia per specificità (diretti cioè verso antigeni differenti del microrganismo e quindi più o meno significativi), sia per proprietà biologiche (anticorpi fissanti il complemento, anlicorpi neutralizzanti o anticorpi precipitanti).

- Il prelievo di sangue -

Sono diversi i fattori che possono interferire e quindi alterare o modificare la qualità del siero o del plasma sanguigno, e quindi condizionare i risultati delle prove sierologiche.

Tra questi, i più importanti sono: le contaminazioni microbiche, l'emolisi, le variazioni notevoli della temperatura. Per evitarli è indispensabile rispettare alcune regole durante il prelievo di sangue, la sua conservazione e il trasporto in laboratorio.

Prelievo di sangue e ottenimento del siero e del plasma.

Il prelievo del sangue deve essere effettuato rapidamente e accuratamente, attraverso una cute precedentemente rasata e disinfettata, evitando ogni traumatismo alla vena. É consigliabile prelevare il sangue direttamente in una provetta sterile, di vetro o di plastica, in cui è stato creato il vuoto (tipo vacutainer).

Per ottenere il siero, il sangue prelevato viene lasciato "a riposo" per almeno 2 ore, a una temperatura stabile compresa tra i 10 e i 20 'C. Dopo la completa formazione del coagulo, questo viene "scollato" delicatamente dalle pareti della provetta, mediante un filo metallico o una pipetta Pasteur.

Dopo averlo recuperato, il siero viene sottoposto a centrifugazione, a 500-1.000 g, al fine di allontanare gli eventuali globuli rossi rimasti.

Per ottenere invece il plasma sanguigno, si i utilizzano per il prelievo provette contenenti coagulanti, quali l'eparinato di Etio, (15 U/ml di sangue). La provetta viene capovolta più volte, delicatamente, e successivamente mente centrifugata.

Queste precauzioni riducono notevolmente, il rischio di una contaminazione microbica e la comparsa di emolisi.

- Conservazione e trasporto del siero. -

Se il siero viene subito sottoposto ad esame, lo si può conservare fino a 2 ore, se a temperatura ambente < 25 °C, oppure sino a 48 ore se posto in un refrigeratore (+4°C). La conservazione a 4°C può essere prolungata anche per una settimana, prevedendo però l'aggiunta di sostanze preservanti antimicrobiche (es., sodio, formolo o mertiolato alla concentrazione 0,1%, peso/volume; oppure fenolo allo 0,5%, volume/volume); in alternativa, è possibile filtrare il siero attraverso membrane filtranti con porosità pari a 0,45 lim.

Per usi successivi, il siero viene aliquotato in piccole quantità e conservato in congelatore a temperature pari o inferiori a - 20°C. Infatti, il congelamento e lo scongelamento ripetuti alterano le caratteristiche chimico-fisiche delle immunoglobuline.

Per l'impiego, i campioni di siero congelati devono venire scongelati o rapidamente mediante immersione delle provette in bagnomaria a 37°C, oppure lentamente (circa 18 ore) ponendoli a + 4°C. Per il trasporto, i campioni di siero devono venire trasportati in contenitori termici, che mantengano una temperatura non superiore ai + 4°C.

In tutti i casi, le provette con i sieri devono essere tappate (per limitare l'evaporazione e le contaminazioni microbiche) e tenute al riparo dalla luce.

6. REAZIONI SIEROLOGICHE

Le tecniche di laboratorio che sfruttano la reattivìtà immunologica per rilevare e quantificare gli anticorpi e gli antigeni di interesse clinico o diagnostico vengono classificate nelle seguenti categorie:

prove di precipitazione
prove di agglutinazione
prove che utilizzano il complemento
prove di neutralizzazione
prove che impiegano anticorpi o antigeni marcati (es., immunofluorescenza, tecniche radioimmunologiche, tecniche immunoenzimatiche),

- prove di precipitazione (antigeni in soluzione) -

La precipitazione interviene quando l'antigene, in soluzione acquosa, viene posto a contatto con l'anticorpo (cioè con il siero) in presenza di elettroliti, ad esempio in soluzione fisiologica; affinché la reazione avvenga, devono però essere opportunamente scelte sia la concentrazione di ciascuno dei reagenti, sia le altre condizioni sperimentali, quali la temperatura e il tempo di incubazione. In questa reazione, l'antigene (come del resto, e ovviamente, l'anticorpo) è inizialmente in uno stato dì soluzione colloidale,

Si possono ottenere reazioni anche con antigeni chimicamente purificati come ad esempio un polisaccaride batterico. In questo modo si riesce a eliminare la complessità reattiva, indotta dall'enorme molteplicità degli antigeni presenti sulla superficie di un batterio o di un globulo rosso, come avviene invece nell'aggIutinazione. E possibile anche, come ha fatto Landsteiner, preparare antigeni sintetici, la specificità dei quali è determinata da gruppi chimici elementari e noti, e studiare la loro precipitazione (flocculazione) ad opera di anticorpi specifici.

Il titolo precipitante di un siero può essere determinato valutando la più piccola quantità di esso che sia in grado di precipitare una quantità standard fissa di antigene; oppure si può, di fronte a una quantità fissa dì siero, porre quantità scalari di assistesse e osservare fino a quale punto si ottenga ancora reazione. Ambedue i metodi sono utili allo scopo e a una certa diluizione la reazione scompare. Il grado di attività di un siero o di un antigene viene indicato dall'ultima diluizione che consente dì evidenziare la reazione.

precipitazione in provetta

La reazione di precipitazione può essere evidenziata mescolando anticorpi e antigeni solubili in provetta, mediante il metodo delle diluizioni, già descritte, oppure con la cosiddetta tecnica zonale, ove il siero viene stratificato in provetta al di sotto dell'antigene: in caso di positività si nota la comparsa, nella zona di contatto dei due reagenti, di un anello opalescente dovuto a fenomeni di precipitazione, assenti in caso di reazione negativa.

La tecnica della precipitazione viene impiegata per diagnosticare diverse malattie infettive o per differenziare specie microbiche appartenenti a uno stesso genere (es., streptococchi); ancora, viene sfruttata per diagnosticare se materiali proteici vari provengono da una specie animale, piuttosto che da un'altra (es., per controllare l'origine della carne presente in un insaccato, oppure per stabilire se una macchia di sangue proviene da un uomo o da altre specie animali).

Precipitazione in gel di agar o in altri substrati

In questo caso uno o entrambi i reagenti diffondono in un gel (agar, agarosio, amido, membrane di cellulosa gelatinizzata) dando origine a una reazione di precipitazione nel punto in cui si incontrano in concentrazione ottimale. Si formano così bande di precipitazione ben visibili e separate. Ogni sistema antigene-anticorpo, infatti, dà origine a una distinta linea di precipitazione, per cui è, ad esempio, possibile identificare i singoli componenti antigenici in una soluzione che li contenga contemporaneamente e, nello stesso tempo, stabilire le affinità esistenti tra essi.

Gel-diffusione doppia-bidimensionale: questa tecnica, nota anche come metodo di Oucherlony, prevedela diffusione dell’antigene e dell’anticorpo da due pozzetti adiacenti ricavati in uno strato di agar. I due reagenti si diffondono attraverso l’agar e formano un precipitato visibile nella zona del gel dove si incontrano in proporzione ottimale. Le linee di precipitazione che si formano consentono di stabilire non soltanto la presenza di più antigeni o più anticorpi reattivi, ma anche di identificarli con certezza, mediante confronto con le linee di precipitazione ottenute con reagenti di riferimento standard.
Gel-diffusone radiale: il metodo, noto anche come tecnica di Mancini, consente una valutazione semiquantitativa della concentrazione dell’antigene o dell’anticorpo. Uno dei due reagenti è incorporato nello strato di agar; dopo solidificazione si preparano numerosi pozzetti che vengono riempiti con i diversi campioni di antigene, di cui si vuole determinare la concentrazione. L’antigene, diffondendo nel gel contenente l’anticorpo, dà origine ad anelli di precipitazione il cui diametro è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’antigene stesso.

Immunoelettroforesi

É una procedura impiegata per l'analisi di campioni costituiti da miscele di proteine (es., siero). Prevede due stadi successivi:

elettroforesi della miscela antigenica in un adatto gel (es., agarosio, acetato di cellulosa) in modo da separare i singoli costituenti in base alla loro mobilità elettroforetica;
deposito di un antisero specifico per alcune o tutte le componenti proteiche, in una scanalatura laterale, parallela alla direzione della migrazione elettroforetica. Le proteine separate dall'elettroforesi ei loro anticorpi omologhi diffondono quindi nel gel, le une contro gli altri, dando origine a linee o archi di precipitato nei punti in cui si incontrano in proporzioni ottimali.

Questa tecnica si presta in modo particolare allo studio delle diverse componenti del siero, sia dell'uomo sia degli animali, per la maggiore capacità di risoluzione rispetto agli altri metodi.

- Prove di agglutinazione -

malattie infettive

La reazione di agglutinazione non differisce sostanzialmente, nel meccanismo, da quella di precipitazione; infatti, lo stesso anticorpo è in grado di esplicare azione precipitante o aggIutinante in funzione solo dello stato fisico-chimico dell'antiene. Se questo, anziché disciolto nel mezzo, è costituito da elementi corpuscolati (es., i rossi o batteri) si avrà reazione di aggIutinazione.

Anche nel fenomeno di aggIutinazione son determinanti la presenza di elettroliti e il rispetto di tutte le altre condizioni sperimentali, quali temperatura e il tempo di incubazione.

La reazione di agglutinazione può essere eseguita, oltre che in provetta, diluendo, per raddoppio, l'anticorpo anche su vetrino (prova rapida). Si allestiscono cioè una sospensione adatta di antigene e una diluizione adatta, di siero; quindi una goccia dell'uno viene mescolata con una goccia dell'altro: in caso di reazione positiva si vedrà comparire in pochi minuti un'evidente aggIutinazione, che mancherà, ovviamente, in caso di reazione negativa.

Una metodica di questo genere viene impiegata spesso nella diagnosi di molte malattie e soprattutto

nell'identificazione di varie specie batteriche e dei gruppi sanguigni.

In campo animale, oltre alla prova di agglutinazione rapida su vetrino, è stata messa a punto un'altra reazione che sfrutta sempre il fenomeno dell'agglutinazione e che viene eseguita utilizzando il latte. Questa reazione, detta ring test (prova dell'anello), viene spesso impiegata per la diagnosi di brucellosi nei bovini. Infatti, nel latte di una bovina affetta da brucellosi possono essere presenti anticorpi, che provengono dal torrente circolatorio o che sono prodotti in loco, a seguito di infezione mammaria (gli anticorpi sono sempre assenti se la bovina non è, o non è stata precedentemente, colpita da infezione brucellare).

Per svelare la presenza di tali anticorpi, si aggiunge al latte una sospensione di brucelle, uccise al calore e opportunamente colorate con ematossilina. Dopo adatto periodo dì incubazione,se la prova è negativa, il latte rimane uniformemente bluastro, mentre in superficie affiora, sotto forma di un anello biancastro, la panna. Se invece la prova è positiva, gli anticorpi, fissandosi alle brucelle colorate, ne aumentano la superficie e a ciò conseguono fenomeni di adsorbimento delle brucelle stesse sui globuli di grasso. Tutte le brucelle vengono quindi adsorbite dalla panna e il latte rimarrà del tutto incolore, mentre in superficie si avrà la formazione di un anello nettamente bluastro, costituito appunto dal -fisso che ha adsorbito le brucelle.

- Inibizione dell'emoagglutinazione da virus -

Alcuni virus, dotati di emoagglutinine, sono capaci di legarsi ai globuli rossi, determinandone l'agglutinazione. Poiché questa reazione viene inibita dalla presenza di anticorpi virus-specifici è possibile titolare questi ultimi con una tecnica nota appunto come inibizone dell'emoaggIutinazione virale o reazione di Hirst

Il test, che presenta un'elevata sensibilità accompagnata, in genere, da grande specificità, misura la quantità di anticorpi che si legano dirrettamente all'emoagglutinina virale che è generalmente un antigene superficiale del virione. La sua esecuzione consiste nell'aggiunta una sospensione di globuli rossi a una serie di miscele costituite da varie diluizioni, per raddoppio del siero in esame e da una quantità standardizzata di virus, in genere 4 unità emoaggluti (UEA). Dopo sedimentazione delle emazie, si procede alla lettura dei risultati: il titolo degli anticorpi inibenti l'emoaggIutinazione è rapportato dalla più alta diluizione di siero capace prevenire l'emoagglutinazione da virus. Il riconoscimento dell'emoaggIutinazione è basato sull'esame dei globuli rossi dopo sedimentazione sul fondo di pozzetti in apposite piastre: in presenza di aggIutinazione, gli eritrociti si dispongono in un sottile strato granulare a margini irregolari, che ricopre tutto il fondo; al contrario, gli eritrociti normali si depositano do raccogliendosi nel centro a formare un, di bottone a margini ben definiti.

- Emolisi e batteriolisi -

Se, dopo aver posto i globuli rossi a contatto con il relativo anticorpo, si aggiunge del C’ (in pratica siero di sangue fresco e normalmente si usa allo scopo quello di cavia), si vedrà comparire "emolisi" questo fenomeno è dovuto alla dissoluzione dei globuli rossi ad opera del C’ stesso. Fenomeni di lisi, fondamentalmente identici, si possono ottenere quando, sempre in presenza di C’, sostituiamo i globuli rossi con batteri sensibilizzati dal rispettivo anticorpo. A causa della diversa struttura chimico-fisica della parete cellulare, i batteri Gram-negativi sono molto sensibili alla lisi, mentre i Gram-positivi non vengono lisati, ma solo uccisi a seguito delle alterazioni a carico della membrana citoplasmatica.

Nel fenomeno di lisi bisogna quindi distinguere due tempi: l'uno conseguente all'aggiunta dell'anticorpo e che porta soltanto a fenomeni di agglutinazione, l'altro conseguente all'aggiunta del CI e che porta alla lisi.

Il C’, a differenza dei vari anticorpi, è sempre presente nel siero di sangue di ogni animale. Soltanto se si è avuta una specifica unione di un antigene e del rispettivo anticorpo, il C’ viene attratto e può esplicare la sua attività litica di tipo enzimatico. Il C', aggiunto a una sospensione di globuli rossi che non contenga il rispettivo anticorpo, non determinerà mai emolisi. Si rammenta che il complemento, a differenza degli anticorpi, non solo è aspecifico, interviene cioè su qualsiasi complesso Ag-Ac, ma è anche termolabile, in quanto, sottoposto a un trattamento termico di 56 'C per 30 minuti, perde la sua attività; gli anticorpi non vengono invece distrutti da tale trattamento.

- Fissazione dei complemento -

Avendo a disposizione del siero di sangue e volendo conoscere se in esso sono presenti anticorpi contro un determinato antigene, si fa normalmente ricorso a una reazione dì tipo precipitante o agglutinante. Talvolta però la valenza dell'antigene o la reattività dell'anticorpo sono inadeguate a tale fine e non è quindi possibile evidenziare a occhio nudo alcun fenomeno reattivo; d’altro canto l’anticorpo, per quanto in maniera non visible, si è legato al rispettivo antigene ed è noto che il complesso così formato determina l’attrazione del complemento (C’). Aggiungendo quindi del C’ questo viene fissato, ossia “consumato”. Se successivamente si aggiungono anche globuli rossi sensibilizzati dal rispettivo anticorpo, non si avrà emolisi perché manca il C’, che è stato consumato nella reazione precedente. In caso di mancata reazione iniziale, invece, l'emolisi avverrà, in quanto il C’ è rimasto libero.

malattie infettive

Pertanto se non compare emolisi la reazione è positiva, ossia è precedentemente intervenuta una reazione antigene-anticorpo; quando si verifica emolisi la reazione è invece negativa.

- Sieroneutralizazione virale -

Quando un virus viene posto a contatto con il siero di un soggetto convalescente o di un anima- le immunizzato, perde del tutto o in gran parte il suo potere infettante, La più probabile spiegazione del fenomeno è che gli anticorpi specifici rivestono la superficie dei virioni, costituendo uno strato esterno che impedisce stericarnente l'adsorbimento del virus alla cellula ospite e conseguentemente il passaggio dell'acido nucleico VIrale nella cellula.

Il potere infettante di un virus può essere facil-mente dimostrato in base ai diversi effetti patologici che esso può determinare in un ospite, o in un sistema cellulare recettivo; poiché tali effetti possono essere detrminati da un quantitativo assai modesto di particelle virali, analogamente le quantità di anticorpi richieste per neutralizzare questi effetti possono essere assai modeste. Le prove di neutralizzazione pertanto sono molto sensibili e spesso altamente specifiche.

In pratica, il tasso di anticorpi neutralizzanti nel siero può essere valutato nel seguente modo: diluizioni seriali, per raddoppio, del siero in esame vengono mescolate con quantità standard di virus infettante, di solito 100 DITC50 e lasciate reagire a temperatura adatta per un tempo appropriato, a seconda del virus (in genere 1-2 ore a temperatura ambiente).

Le diverse miscele virus-siero sono quindi saggiate per rilevare l'infettività residua, mediante una procedura convenzionale di titolazione al "punto finale", che si realizza sul substrato biologico (colture di tessuto, uova embrionate di pollo, animali da esperimento) più idoneo per mettere in evidenza l'infettività del virus in esame.

Titolo finale degli anticorpi neutralizzanti viene considerata la più alta diluizione del siero ancora capace di prevenire i fenomeni legati alle proprietà infettanti del virus.

malattie infettive

- Immunofluorescenza -

É possibile rendere visibile una reazione antigene-anticorpo marcando uno dei reagenti con sostanze, chiamate fluorocromi (fluoresceina, rodamina), che hanno la capacità di emettere fluorescenza (rispettivamente verde e rossa), se osservate con un microscopio a luce ultravioletta (UV). La tecnica è applicabile a sezioni di tessuto, colture cellulari o strisci di sospensioni di cellule animali, batteriche e protozoarie. Si presta pertanto ottimamente per individuare e localizzare con precisione un microrganismo patogeno nei tessuti infetti, oppure complessi antigene-anticorpo. Ancora, viene utilizzata per rilevare gli anticorpi specifici del siero di sangue; in questo caso il microrganismo o il particolare antigene verso cui si cercano gli anticorpi viene fissato su vetrino e quindi si procede con la cosiddetta "tecnica di immunofluorescenza indiretta".

Due sono i metodi principali utilizzati per l'immunofluorescenza.

malattie infettive Nel metodo diretto (per la ricerca degli antigeni) sono coinvolti solamente gli antigeni e gli anticorpi specifici coniugati con la fluoresceina.

Questo metodo è usato comunemente per identificare i diversi sierotipi dei microrganismi (es., E. coli, Klebsiella, Streptococcus, Leptospira e Candida), oppure per diagnosticare un'inibizione rilevando direttamente nei prelievi bioptici gli antigeni del patogeno.

Con il metodo indiretto (per la titolazione c gli anticorpi o per la ricerca degli antigeni chiamato anche "tecnica sandwich", anticorpi specifici non vengono coniugati e la loro unione con l'antigene viene dimostrata con l'aggiunta successiva di anti-gammaglobuline coniugate. In questo caso, se c'è stata un'iniziale combinazione tra l'antigene e gli anticorpi specifici, questi ultimi funzionano da antigeni, cui legano le anti-gammaglobuline coniugate e complesso presenta fluorescenza.

Le anti-gammaglobuline che vengono coniugate te con la fluoresceina sono dirette verso gli anti corpi della stessa specie animale che ha fornito anticorpi nella reazione primaria. Ad esempio, gli anticorpi specifici per il virus provengono un siero bovino, le anti-gammaglobuline vengo preparate inoculando un animale (in genere, coniglio o capra) con globuline normali di bovino.

La metodica indiretta presenta, rispetto quella diretta, alcuni vantaggi, dei quali i più i portanti sono una maggiore sensibilità e la possibilità di mettere in evidenza qualsiasi interazione tra antigeni e anticorpi di una determinata specie animale con un solo reagente coniugato. Questo metodo trova soprattutto impiego nel rilievo e nella titolazione (saggiando diluizioni per raddoppio del siero esame) sia di anticorpi per la sierodiagnosi de malattie infettive e infestive, sia di autoanticorpi quali quelli anti-nucleari nel lupus eritematoso.

7. TECNICHE RADIOIMMUNOLOGICHE

Queste tecniche, meglio note con il termine inglese radioimmunoassay (RIA), rappresentano un metodo versatile e sensibile per misurare il livello sierico di sostanze quali farmaci, ormoni e altri prodotti biologici che si comportano da antigeni o da apteni e che si possono marcare con sostanze radioattive.

Il principio della procedura si basa sulla competizione, per l'anticorpo specifico, tra una quantità nota di sostanza marcata radioattivamente (es., un ormone) e una quantità sconosciuta dello stesso tipo di ormone presente nel campione in esame. 1 complessi antigene-anticorpo che sì for mano vengono separati mediante centrifugazione o immunoprecipitazione e si valuta quindi la radioattività residua. La concentrazione sconosciuta dell'ormone viene rilevata confrontando ì risultati della prova rispetto a una curva di taratura ottenuta aggiungendo, alla dose nota di or-mone radioattivo, dosi conosciute e crescenti di ormone non marcato. In alternativa, il metodo può essere condotto; marcando con radioisotopi le molecole anticorpali, sempre con la finalità di rilevare e quantificaticare un antigene specifico, che può essere anche

rappresentato da un'immunoglobulina.

Le tecniche radioimmunologiche presentano comunque lo svantaggio di richiedere l'impiego di isotopi radioattivi potenzialmente pericolosi.

8. TECNICHE IMMUNOENZIRNATICHE (ELISA)

Le tecniche immunoenzimatiche derivano da quelle radioimmunologiche, ma utilizzano un enzima, al posto dell'isotopo radioattivo, come marker dell'anticorpo specifico o dell'anti-gammaglobulina. Presentano una sensibilità notevole per il fatto che una sola molecola di enzima può reagire con un elevato numero di molecole di substrato, determinando una reazione colorimetrica anche in presenza di titoli anticorpali modesti.

Più in particolare, il presupposto delle tecniche immunoenzimatiche si basa sul fatto che sia un antigene, sia un anticorpo possono venire legati a un enzima, in modo tale che il risultante coniugato possieda entrambe le attività: immunologica ed enzimatica.

Lo sviluppo di questa tecnica, dopo l'iniziale impiego per la localizzazione e il rilievo degli antigeni nei tessuti e negli organi, è stato realizzato fissando un antigene o un anticorpo solubili a una fase solida, in modo che la reattività della componente immunologica venisse perfettamente conservata. Più precisamente, nella tecnica ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) classica, che trova impiego nella titolazione degli anticorpi specifici presenti in un siero, gli antigeni sono adsorbiti passivamente alle pareti di provette di plastica, o di pozzetti di apposite piastre microtitre e, dopo lavaggio per togliere la quota che non si è fissata, messi a contatto con i sieri da saggiare.

Se nel siero sono presenti anticorpi specifici, essi si combinano con l'antigene; l'aggiunta di anti-gammaglobuline marcate con l'enzima (perossidasi o fosfatasi alcalina), determina la formazione di complessi antigene/anticorpo/antigammaglobuline marcate. La quantificazione degli anticorpi specifici è ottenuta, come già accennato, aggiungendo il substrato dell'enzima e misurando la reazione colorimetrica visivamente o allo spettrofotometro.

Questo metodo trova ampio impiego, oltre che per la sierodiagnosi di malattie infettive e infestive, anche per lo screening degli anticorpi monoclonali, per individuare cioè quale clone linfocitario ibridato produce l'anticorpo specifico.

- REAZIONI IMMUNOLOGICHE AD APPLICAZIONI SPECIALI -

- Western blotting (immunoblotting) -

Questa tecnica, che si rifà in linea di principio a un'analoga procedura usata per l'analisi del DNA, è ormai entrata nella routine, sia per la caratterizzazione delle proteine, sia per la valutazione della specificità epitopica degli anticorpi monoclonali. Più precisamente, la tecnica prevede, in una prima fase, la separazione di una miscela di proteine, oppure di frammenti diversi di un virus (demolito enzimaticamente o con detergenti, quali il sodiododecilsolfato, SDS) mediante elettroforesi in gel di poliacrilamide.

Il gel viene successivamente deposto su un foglio di nitrocellulosa o di nylon e quindi si induce, in un'apposita camera elettroforetica, un flusso di soluzione tampone che migri attraverso il gel verso il foglio di nitrocellulosa: le diverse bande proteiche separate sul gel migrano così alla nitrocellulosa ove si fissano.

Successivamente, viene distribuito sulla nitrocellulosa un anticorpo monoclonale specifico per l'antigene che si vuole individuare e caratterizzare: l'anticorpo si legherà esclusivamente coli la banda che contiene l'antigene omologo, indicandone l'esatta posizione che aveva nel gel. La procedura trova, ancora, ampio impiego anche per definire la purezza e la specificità degli anticorpi monoclonali che, se effettivamente monospecifici, dovranno reagire con una sola delle bande, ottenute facendo migrare nel gel di poliacrilamide una miscela antigenica. La reazione antigene-anticorpo viene resa visibile mediante un anti-anticorpo marcato con un enzima, che, dopo aggiunta del substrato cromogeno, darà luogo alla colorazione della banda in cui è presente l'antigene che si sta cercando. La tecnica del Western blotting viene anche impiegata, in immunologia clinica, per identificare lo stadio evolutivo di alcune malattie infettive (es., AIDS) attraverso il rilievo della reattività anticorpale specifica verso i diversi epitopi del virus o di eventuali cross-reattività del siero del paziente.

- Valutazione della sensibilità dei microrganismi al chemioantibiotici (antibiogramma) -

Tutti i chemioantibiotici possiedono uno spettro antibatterico caratteristico e quindi diverso da farmaco a farmaco. L'efficacia dei chemioantibiotici su di un numero più o meno rilevante di specie microbiche determina quella che viene comunemente definita l'ampiezza dello spettro d'azione. Antibiotici, come il cloramfenicolo e le tetracicline, e chemioterapici come i sulfamidici possono essere considerati "ad ampio spettro d'azione", mentre antibiotici come la spiramicina e la gentamicina e chemioterapici come i nitrofurani sono da considerarsi "a medio spettro d'azione". Rimangono da ricordare i farmaci "a stretto spettro d'azione" come la benzilpenicilliina o la bacitracina, che rivolgono la loro azione su poche specie batteriche.

La sensibilità di un determinato microrganismo a un farmaco è il fattore che, a parità di condizioni farmaco-tossicologiche, determina la scelta di un chemioantibiotico piuttosto che di un altro.

- Antibiogramma mediante diffusione in piastra su terreno agarizzato -

Nella pratica clinica la disponibilità di un numero sempre crescente di antibiotici e la comparsa di ceppi resistenti ai farmaci, sebbene appartenenti a specie definite inizialmente sensibili, ha suggerito l'opportunità di predisporre dei saggi di attività antimicrobica in vitro, al fine di determinare, prima di iniziare la terapia l'antibiotico più attivo sul ceppo microbico ritenuto responsabile di un processo infettivo.

I metodi per diffusione su agar prevedono l'uso di piastre di Petri, allestite con terreno solido, sulle quali, dopo la semina in superficie o per inclusione del ceppo batterico patogeno isolato, si depongono dei dischetti di carta bibula imbibiti con quantità standardizzate dei singoli antibiotici. Dopo incubazione (in genere a 37°C per 18-24 ore), si misurano gli aloni di inibizione della crescita batterica attorno ai vari dischetti e i ceppi batterici verranno definiti "sensibili", "intermedi" o "resistenti" in funzione dei diametri di tali aloni di inibizione (metodo di Kirby-Bauer).

9. BIOTECNOLOGIE

Sono tutti procedimenti che si basano sulla manipolazione del DNA.

- Denaturazione del DNA -

Una delle caratteristiche che rende il DNA il depositario dell'informazione genetica è la sua stabilità intrinseca. Le trasformazioni chimiche che avvengono spontaneamente sono in genere troppo lente in assenza di un catalizzatore enzimatico. La conservazione per lunghi periodi di tempo dell'informazione senza alterazioni è tanto importante per una cellula che }e reazioni che alterano il DNA, anche se molto lente, diventano fisiologicamente significative.

Le soluzioni di DNA nativo, isolato con molte precauzioni, sono altamente viscose a pH 7,0 e a temperatura ambiente (25°C) Quando una di queste soluzioni viene portata a pH estremi oppure a temperature sopra gli 80°T, la sua viscosità diminuisce bruscamente, indicando che il DNA ha subito una trasformazione fisica. Il calore e pH estremi, così come determinano la denaturazione delle proteine globulari causano anche la denaturazione o fusione del DNA a doppia elica. Il processo avviene mediante la rottura dei legami idrogeno tra le basi appaiate e delle interazioni idrofobiche tra le basi impilate. Come risultato, la doppia elica si apre liberando le due catene singole, completamente separate per tutta la loro lunghezza o per parte della loro lunghezza (denaturazione parziale della molecola). 1 legami covalenti del DNA non vengono rotti.

La rinaturazione del DNA è un processo rapido a una sola tappa, se le due catene sono ancora unite da un segmento a doppia elica di una decina o più di residui, Quando la temperatura o il pH vengono portati a valori vicini a quelli fisiologici, i segmenti srotolati delle due catene si riavvolgono (riassociazione o annealing) spontaneamente rigenerando il duplex intatto.

Se le due catene sono completamente separate, la rinaturazione avviene in due tappe: la prima è relativamente lenta, in quanto le due catene devono prima «trovarsi» mediante collisioni casuali e formare un breve segmento di doppia elica complementare. La seconda tappa è molto più rapida: le coppie di basi rimaste non appaiate entrano facilmente in contatto tra loro e le due catene si uniscono «a cerniera» da sole formando la doppia elica completa.

Ogni specie di DNA ha una temperatura di denaturazione caratteristica, detta anche punto di fusione: il punto di fusione del DNA è tanto più alto quanto più alto è il suo contenuto in coppie di basi G-C.

- Estrazione del DNA -

Questo metodo consente il rilascio di DNA allo stato puro grazie all’azione di sostanze lisanti, trattamenti termici e meccanici (forze centrifughe).

Questa tecnica consente di effettuare diagnosi di malattie infettive anche su materiale in putrefazione.

- elettroforesi del DNA -

I frammenti di DNA sono in grado di migrare se messi in campo elettrico: usando la tecnica dell’elettroforesi su gel, è possibile isolare i diversi frammenti di DNA presenti in una molecola.

- PCR -

Se si conosce almeno una parte di sequenza del segmento di DNA da clonare, il numero di copie del segmento di DNA può essere aumentato mediante un processo chiamato reazione polimerasica a catena (polymerase chain reaction o PCR), ideata da Kary Mullis nel 1983. Il DNA amplificato può essere direttamente clonato o utilizzato per una grande varietà di metodiche analitiche. La PCR è di una semplicità estrema. Vengono sintetizzati due oligonucleotidi sintetici, ognuno dei quali è complementare a una breve sequenza di una delle due catene del segmento di DNA bersaglio, sequenze poste poco dopo le estremità del segmento da amplificare Questi oligonucleotidi sintetici si comportano da iniziatori (primer) della replicazione del segmento di DNA.

Il DNA isolato, contenente il segmento da clonare viene denaturato ad alta temperatura per breve tempo, quindi raffreddato in presenza di molti oligonucleotidi sintetici con funzione di iniziatori. Vengono quindi aggiunti i quattro deossinucleosidi trifosfato; il segmento di DNA compreso tra i due iniziatori viene selettivamente replicato. Questo processo si ripete per un numero di cieli variabile da 25 a 30; tutto il processo richiede solo poche ore, se è effettuato con un sistema automatizzato; in questo modo il segmento di DNA fiancheggiato dagli iniziatori viene amplificato per essere facilmente isolato e/o clonato.

In sintesi, ogni ciclo si compone di tre fasi:

•Denaturazione del DNA: separazione dei filamenti mediante riscaldamento (80°C)

•Annealing dei primers: appaiamento dei singoli filamenti con i primers, ossia oligonucleotidi con una sequenza complementare a quella a monte della sequenza interessata. I primers sono fattori d’innesco, con una sequenza di 18-20 basi, non hanno complementarietà specifica e sono due, forward e reverse, per legarsi alle catene 3’5’ e 5’3’

•Extension: sintesi del DNA ad opera della DNA-polimerasi

Nella PCR viene usata una DNA polimerasi resistente alle alte temperature, come la polimerasi Taq I ottenuta da un batterio che vive in acqua a 90°C. L'enzima rimane attivo dopo ogni tappa di riscaldamento e non deve essere rimpiazzato. Uno studio attento della sequenza degli iniziatori da utilizzare nella PCR consente di inserire siti di restrizione che facilitano poi il clonaggio successivo del DNA amplificato.

Il metodo della PCR è tanto sensibile da permettere l'individuazione e l'amplificazione anche di una sola molecola di DNA in pressoché ogni tipo di campione. Anche se il DNA tende a degradarsi nel tempo, con l'aiuto della PCR è stato clonato con successo DNA ottenuto da campioni di oltre 40.000 anni fa.

Gli epidemiologi usano la PCR su resti umani per seguire l'evoluzione di virus patogeni. Oltre alla sua utilità per il clonaggio del DNA, questa tecnica è di grande importanza per la medicina legale è anche usata per la diagnosi di infezioni virali prima dell'esordio clinico o della comparsa della risposta immunitaria, e per la diagnostica prenatale di numerose malattie genetiche.

Bibliografia

G. Poli – Microbiologia e immunologia – UTET

Lehninger – I principi di biochimica - Zanichelli

Fine articolo sulle malattie infettive

Epidemiologia: disciplina ke si occupa dello studio delle malattie e dei fenomeni ad esse correlati attraverso l’osservazione della distribuzione e dell’andamento delle patologie nella popolazione, l’individuazione dei fattori di rischio e la diffusione, nonkè la programmazione degli interventi preventivi e curativi

Ambiti di applicazione: studio dei fenomeni epidemici \ ricostruzione della storia naturale delle malattie e della loro diffusione \ identificazione dei fattori di riskio e di quelli protettivi \ valutazione degli interventi sanitari preventivi, diagnostici e terapeutici \ definizione delle priorità in sanità pubblica \ determinazione di parametri x la valutazione di efficacia, efficienza e qualità dei S.S.

Malattie infettive: caratterizzate dall’esposizione al patogeno; si hanno periodo di incubazione, comparsa di sintomi aspecifici, malattia conclamata ed infine guarigione, cronicizzazione o morte (anke x patogeni opportunisti). Il portatore sano è colui che pur ospitando il patogeno non manifesta sintomi clinici e può costituire 1 possibile sorgente di infezione

Malattie CD: sono implicati i fattori di riskio; si ha 1 fase di latenza, 1 fase in cui la malattia è già in atto ma non vi sono sintomi detta fase preclinica ed infine la fase conclamata, dove nella magg dei casi ogni approccio terapeutico non apporta sostanziali modificazioni al decorso cronico della malattia

Fattori d riskio: genetici \ ambientali \ occupazionali \ individuali

Prevenzione

1°: promozione e mantenimento della salute attraverso interventi individuali o collettivi effettuati sulla popolazione sana (identificazione focolai infettivi, interventi di bonifica ambientale, vaccinazione – campagne d informazione sanitaria, norme antinquinamento)

2°: identificazione precoce della malattia o d condizioni a riskio seguita dall’immediato intervento terapeutico x interromperne o rallentare il decorso (screening, intervento kirurgico e\o sanitario)

3°: prevenzione delle complicanze di 1 malattia già in atto e attuazione di misure atte a ridurre danni ed invalidità

Fonti di dati: skede d morte (causa terminale, intermedia e iniziale) \ certificato d assistenza al parto (nascite, morti, malformazioni) \ notificazione di malattie infettive \ cartelle clinike (anamnesi, decorso clinico, esami e terapie) \ skeda di dismissione ospedaliera (dati anagrafici, caratteristike degenza, diagnosi) \ registri ospedalieri (eleni di prestazioni erogate) \ registri d patologia \ reti sentinelle (medici ke periodicamente inviano i dati su eventi osservati a 1 centro d raccolta) \ amministrazione pubblike \ archivi med gen e pediatria \ internet

TIPI DI MISURE EPIDEMIOLOGICHE

Descrizione del n° d eventi

Rapporti: esprimono la relazione tra 2 quantità indipendenti fra loro

Proporzioni: rapporto particolare, dove il num è incluso nel den, il risultato varia da 0 a 1

Tasso: rapporto tra unità diverse ke introduce la variabile tempo (tutti x 1000)

mortalità: n° morti\popolazione | mortalità spec. n°morti patologia x \ popolazione | natalità: n° nati vivi\popolazione | mortalità infantile: n° morti età<1 anno\n° nati vivi (liv igienico sanitario) | mort neonat: morti<28gg \ n° nati vivi (assist neonatologica) | mort. Postneonat: morti tra 29 e 365 gg \ n° nati vivi (condizioni ambientali) | mort perinat: nati morti + morti<7gg \ n° nati (assist ostetr, e neonat) | mort nati: nati morti \ n° nati | letalità: n° morti dopo diagnosi \ n°casi | sopravvivenza (5 anni): pazienti ancora vivi \ n° casi

Prevalenza: rapporto tra n° d casi e n° dei componenti di una popolazione in 1 dato istante (proporzione) puntuale; periodale se si considera 1 periodo d tempo à utile x quantificare l’entità della patologia

Incidenza: n° dei nuovi eventi in 1 popolazione x unità d tempo \ I. cumulativa: si segue 1 gruppo d soggetti nel tempo x valutare l’instaurarsi della malattia à immagine + realistica del fenomeno in studio

Nel caso d malattie CD con incidenza stabile, il rapporto prev\inc è = alla durata media della malattia

Indicatore: caratteristica ke può essere quantificata ed è associata ad un fenomeno non direttamente misurabile, riguardano lo stato d salute, stili d vita e profili socio-economici

QALY= n° anni x coeff. Qualità vita (1 sano,0 morte, -1 malattia) = indicatore dei benefici derivati da 1 intervento sanitario

DALY= calcola l’impatto d 1 malattia in 1 popolazione e calcola la quantità d anni d vita xduti, partendo dall’aspettativa d vita – i coeff d disabilità

Indicatori assistenza sanitaria: T ospedalizzazione (n°ricoveri\popolazionex1000) | durata media degenza (giornate di degenza \ n° ricoveri) | T occupazione posti letto (giorni di degenza \ posti letto x 365) | Indice di case-mix (n° pazienti con determinate caratteristike \ n° tot pazienti)

Il censimento si svolge attraverso la compilazione di opportuni moduli, le informazioni raccolte sono: dati anagrafici, istruzione, attività, abitazione, beni, abitudini di vita; si possono estrapolare la composizione x sesso e x età, T d fecondità (generale = n° nati vivi \ 15<F<49; totale = n° medio di figli x donna età fertile), indici d vekkiaia (popolazione>65 | <14 x100), tavole di mortalità

Fattori di regolazione: mortalità, natalità e migrazioni

Associazione: grado d dipendenza statistica tra 2 o + eventi variabili

Non causale: determinata da circostanze esterne come errori dovuti al campionamento, presenza di fattori di confondimento, bias

Causale: quando 1 ben definita esposizione provoca o aumenta il riskio d 1 determinato effetto

I fattori causali possono essere necessari quando la loro sussistenza è indispensabile x generare 1 dato effetto o sufficienti quando producono un particolare effetto ke xò può essere causato anke da altri fattori (agenti eziologici nec nn suff \ down nec suff \ nn nec suff xeroderma pigmentoso \ CD nn nec nn suff)

Fattori d riskio CD: predisponenti, creano le condizioni o aumentano la suscettibilità dell’individuo x lo sviluppo d 1 patologia; precipitanti, facilitano il definitivo instaurarsi d 1 malattia (lesioni, malattie, gravidanza); rinforzanti, ke tendono a perpetuare o aggravare la presenza d 1 malattia o condizione morbosa

Associazioni causa-effetto: relazione temporale \ plausibilità biologica \ forza o grado (RR\OD>1) \ consistenza \ relazione dose-risposta \ assenza fattori d confondimento \ reversibilità

Riskio relativo (RR): incidenza esposti \ incidenza nn esposti = eccedenza d riskio degli E rispetto a nn E

Riskio attribuibile individuale (RA): incidenza E – incidenza nn E = quantità d riskio supplementare attribuibile al fattore di riskio

Riskio attribuibile negli esposti (RAE): RA \ incidenza E = proporzione d malati ke può essere evitata rimuovendo il fattore d riskio

Riskio attribuibile d popolazione (RAP): RA x prevalenza fattore riskio = incidenza tot – incidenza nn E = prop d casi d nn ammalati se si rimuove il fattore d riskio

Frazione eziologia (FE): RAP \ incidenza tot = prop tot d malati dovuti al fattore d riskio

L’RR si può calcolare correttamente solo negli studi longitudinali (a coorte), ma se ne può avere 1 stima con L’Odds Ratio (OR), ke è il rapporto fra la prob ke l’evento si verifiki e la prob ke nn si verifiki, si calcola: malato E = A \ nn malato E = B \ malato nn E = C \ nn malato nn E = D; OR = axd \ bxc = (a\b)\(c\d)

TEST DIAGNOSTICI E SCREENING

1 malattia si può identificare tramite sintomi, segni e test diagnostici

Lo screening è 1 procedura ke consente la presuntiva identificazione d 1 malattia in fase iniziale o d 1 condizione a riskio mediante l’applicazione d 1 test, si può applicare a malattie già in corso o in condizioni predisponenti; può inoltre essere usato x scopi d ricerca ed tutela d 1 popolazione

Caratteristike fondamentali degli scr sono: riproducibilità, validità (interna = grado d conformità del risultato rispetto al campione; esterna = possibilità d generalizzare i dati su altre realtà),

positivo M = A | positivo nn M = B | negativo M = C | negativo nn M =D

Scr a risultati dicotomici --- sensibilità: proporzione d persone positive al test tra quelle malate (Φ fi=a\a+c); specificità: proporzione d persone negative tra quelle nn malate (Ψ psi=d\b+d)

Valore predittivo del test positivo (PV+): proporzione d realmente malati fra i positivi = a\a+b

Valore predittivo del test negativo (PV-): proporzione d realmente sani fra i negativi = d\c+d

I valori predittivi dipendono da quanto è diffusa la patologia

Efficacia complessiva: proporzione tra veri negativi e veri positivi sul tot = a+d\n x 100

Test bias: errore insito, rapporto fra positivi e malati = a+b\a+c

In Scr a variabili continue si stabilisce il valore soglia (cut-off)

In 1 scr sono da considerare anke: costo, efficacia, modalità tecnike, non invasività,conseguenze psicologike su falsi positivi

Tipi di screening: di massa x adulti (pap-test, colon) \ in sogg con familiarità (diabete, ixtensione)\ età neonatale (albinismo, galattosemia) \ preconcezionali e prenatali (malattie genetike, down) \ lavorativi o sportivi (audiometria, spirometria) \ tutela popolazione sana(hiv, epatiti) \ d dubbia efficacia (psa, gastroscopia)

1 scr può essere valutato positivamente se si ha un iniziale aumento dell’incidenza nel caso di test x diagnosi precoce, mentre nel caso di identificazione d condizioni a riskio c si deve aspettare 1 diminuzione dell’incidenza e della mortalità

Tipologie di randomizzazione: semplice (ognuno ha le stesse possibilità), stratificato (suddivisione in sottogruppi ed estrazione), a cluster (divisione in gruppi omogenei come famiglia o condominio ed estrazione)

Indagini in caso di epidemie (comparsa d 1 n° anomalo d casi concentrati nel tempo) : ha lo scopo d valutare la sussistenza d 1 epidemia, individuare le eventuali cause, studiare il patogeno incriminato (nel caso di malattie infettive), la sorgente di infezione e la modalità d trasmissione

L’outbreak è un focolaio epidemico ed è quasi esclusivamente riferito a patologie infettive ad alta infettività e breve periodo d incubazione

La stima del T d incidenza abituale o atteso verrà effettuato a partire dalla curva epidemica, ke si ottiene tracciando le date d inizio dei sintomi dei singoli casi; ha 1 fase ascendente e 1 discendente; può essere simmetrica (spesso d grandi dimensioni) o asimmetrica a destra (focolai epidemici)

STUDI EPIDEMIOLOGICI SPERIMENTALI

Problemi etici: v devono essere buone ragioni scientifike x paragonare 2 o + trattamenti e non vi deve essere evidenza certa d superiorità; bisogna ottenere il consenso informato in forma scritta; se durante lo svolgimento emerge ke 1 trattamento è migliore la sperimentazione deve cessare

Fasi delle sperimentazioni clinike (farmaci da immettere o appena immessi in commercio)

1 – primi studi su 1 nuovo principio attivo condotti su volontari sani

2 – studi terapeutici pilota x dimostrare l’attività e valutare la sicurezza a breve termine in pazienti affetti dalla patologia

3 – studi su gruppi d pazienti + numerosi x valutare l’efficacia, la sicurezza e l’incidenza di effetti collaterali

4 – studi condotti dopo la registrazione del farmaco sulla base delle informazioni contenute nel riassunto delle caratteristike del prodotto

BIAS & CO.

Gli errori possono essere:

dovuti alla variabilità campionaria (errore casuale o random error), in quanto le fluttuazioni sono insite in qualunque studio ke si basa su campioni

sistematici (bias), ke si suddividono in:

bias di selezione: sono quelle distorsioni ke riguardano la modalità con cui i gruppi d soggetti arruolati x l’indagine sono stati selezionati; altri bias d selezione sono dovuti alle xdite al follow-up, alla mancata rispondenza o all’adozioned errati criteri d inclusione o esclusione. X bias di partecipazione si intendono i rifiuti parziali o totali ke comportano 1 inclusione attiva dei soggetti ke s possono autoselezionare sulla base d precise caratteristike.

Bias di informazione: includono tutti gli errori di classificazione, ossia le distorsioni dovute ad erronea o non precisa classificazione dello stato del soggetto in riferimento a sintomi, segni clinici o esposizione a fattori d riskio. I bias di sorveglianza insorgono quando considerando 2 o + gruppi ve ne siano alcuni sottoposti ad 1 + stretta sorveglianza sanitaria x cui il riscontro della patologia risulta facilitato o cmq anticipato. Il recall bias è tipico negli studi caso-controllo in cui il malato è molto + solerte nel ricostruire la sua storia espositiva rispetto al non malato. Un altro bias riguarda gli intervistatori, ke essendo a conoscenza dell’ipotesi eziologia o x sonali convinzioni, tendono a far convergere la risposta verso quella confacente alle proprie convinzioni

Fattori di confondimento: possono portare a ipotizzare relazione causa-effetto del tutto inesistenti ovvero a maskerarne d reali. X fatt d confondimento si intende quindi un fattore associato sia alla malattia che all’esposizione oggetto dello studio. La differenza con i bias sta nel fatto ke essi possono essere valutati e rimossi nella fase di elaborazione dei dati. I + comuni sono età e sesso, oppure il fumo x l’associazione tra tumore al polmone e lavoro

Fattori di riskio multipli e interazione

In alcuni casi la presenza simultanea di 2 o + fattori d riskio può creare una sinergia tale ke l’incidenza della malattia risulta essere superiore rispetto alla somma delle singole incidenze

L’interazione negativa viene detta antagonismo

Malattie infettive

Malattie infettive
a quale famiglia appartiene il citomegalovirus: herpesviridae
a quale famiglia appartiene il virus del morbillo: paramyxoviridae
a quale struttura si lega il virus hiv cd4
agente etiologico più comune di meningite a liquor torbido nell'adulto neisseria meningitidis
attualmente la diagnosi etiologica di polmonite da legionella viene effettuata mediante: identificazione degli antigeni batterici nelle urine
attualmente la via più frequente attraverso cui viene contratta l'epatite c è: attraverso la via parenterale inapparente
caratteristica biologica delle chlamydiae è: sono parassiti intracellulari obbligati
caso clinico: circa 6 ore dopo la fine di una festa di matrimonio, alcuni invitati accusano dolori addominali, vomito e diarrea. quale è la diagnosi più probabile intossicazione da staphyloccocus aureus
caso clinico: donna di 32 anni portatrice di hbv, gravida. quale dei seguenti test è più indicativo di alta infettività al feto hbeag
caso clinico: un paziente hiv+ viene ricoverato perché presenta febbre, cianosi, dispnea. la radiografia del torace evidenzia un quadro di interstiziopatia. l'emogasanalisi rivela po2 60mmhg. la diagnosi più probabile è un'infezione da: pneumocystis carinii
caso clinico: un soggetto di 32 anni portatore di hbv con storia di tossicodipendenza presenta all'ingresso in ospedale ittero, astenia ed importante rialzo delle transaminasi. quale è il virus più probabile di questa nuova infezione hdv
che cosa caratterizza gli streptococchi beta-emolitici coltivati su agar-sangue chiara zona di emolisi completa intorno alla colonia
che cosa differenzia principalmente i micoplasmi dagli altri schizomiceti assenza di parete cellulare
che cosa si intende per "wasting syndrome" calo ponderale >10%, diarrea cronica (almeno 2 scariche/die per 30 gg.) e/o astenia cronica e febbre (per almeno 30 gg.)
come è l'esantema della febbre eruttiva del mediterraneo maculo-papuloso
come si fa la diagnosi di certezza di infezione da hcv presenza di hcv-rna
come si trasmette il virus hiv? per via ematica/rapporti sessuali
come sono i vaccini antinfluenzali impiegati comunemente in italia trivalenti
come sono le brucelle gram negative, acapsulate, asporigene
cosa e' il viral load di hiv: il numero di copie di rna genomico presenti per ml di sangue
cosa può causare la simultanea somministrazione di due vaccini a virus vivo attenuato normalmente una buona risposta nei confronti di entrambe le componenti
cosa si intende per brucellosi cronica " " " 6 mesi
criterio diagnostico di valore essenziale nella polmonite da micoplasmi è: quadro radiologico in contrasto con reperto obiettivo scarso
da quale germe è più frequentemente determinata la polmonite in un paziente con fibrosi cistica: pseudomonas aeruginosa
da quale virus sono provocate le pandemie influenzali virus influenzale a
dei seguenti microrganismi quali hanno antigeni comuni con il proteus vulgaris (ox19, ox2, oxk) rickettsie
diarree nelle comunità infantili nella stagione invernale sono più frequentemente causate da: rotavirus
esame irrinunciabile per la diagnosi di meningite rachicentesi
escherichia coli può essere definito: normale saprofita dell'intestino
esiste un vaccino per tutte le forme di epatite sostenute dai più comuni virus epatotropi solo per l'epatite b e a
esiste un'associazione tra infezione da hcv ed epatocarcinoma: nell'1-3 % dei casi
fattori di rischio per le sepsi sono: tutte le precedenti
gli adenovirus possono determinare: tutte le precedenti
gli agenti eziologici piu' frequenti delle infezioni delle protesi articolari sono: staphylococcus spp
gli aminoglucosidi sono antibiotici: concentrazione-dipendenti
gli anticorpi anti ebna nell'infezione da ebv compaiono: tardivamente
gli pneumococchi in coltura in fase s o liscia hanno la seguente caratteristica: sono virulenti e capsulati
gli streptococchi devono il loro nome alla disposizione a: catenelle
hcv si trasmette da madre a feto: assai di rado
i meccanismi primari di difesa nei confronti dei parassiti intracellulari sono: immunità cellulo-mediata
i meccanismi primari di difesa nei confronti di toxoplasma gondii poggiano su: linfociti t cd4+ e macrofagi
i principali effetti collaterali della terapia con alfa-interferone sono : tutte le precedenti
i seguenti sono tutti parassiti intracellulari obbligati eccetto: neisseria meningitidis
ii più importante contributo alla difesa aspecifica (naturale) dell'ospite contro i virus è fornito da ifn-alfa ed ifn- beta
il batterio più frequentemente isolato nelle infezioni delle vie urinarie è: e. coli
il batterio più frequentemente responsabile di polmoniti in comunità è: streptococcus pneumoniae
il bersaglio, a livello batterico, dell'attivita' delle penicilline e' rappresentato da: parete cellulare
il brivido squassante che precede la febbre è tipico di : sepsi
il ciclo asessuato della malaria avviene esclusivamente nell'uomo
il contagio interumano è la principale modalità di trasmissione di una delle seguenti malattie infettive: parotite epidemica
il fenomeno caratteristico della malattia da graffio di gatto è linfoadenite purulenta
il genoma del virus influenzale è costituito da: rna
il megaloeritema infettivo o quinta malattia è causato da: un virus
il megaloeritema o v malattia colpisce soprattutto: bambini di età compresa tra 5 e 12 anni
il metisoprinolo è: un antivirale
il monitoraggio del soggetto con infezione da hiv ed in trattamento con farmaci antiretrovirali si effettua con: determinazione cd4+ circolanti e viremia hiv
il morbillo ha un periodo di incubazione di: 9-12 giorni
il periodo di incubazione della meningite meningococcica è: 3-4 giorni
il periodo di incubazione della parotite epidemica è in media di: 18 giorni
il periodo di incubazione della varicella è: circa 14 giorni
il periodo di incubazione dell'influenza è di: 1-3 giorni
il periodo finestra per hiv è: il periodo in cui è presente hiv-rna ma gli anticorpi non sono ancora comparsi
il personale sanitario è esposto al rischio di infezione professionale da: hcv+hbv
il quadro clinico del morbo di weil è dominato da: sindrome epato-renale
il reticolo di mya è un reticolo di fibrina che si forma nel liquor in caso di: meningite tubercolare
il riscontro di mic superiori a 2 indica generalmente: resistenza all'antibiotico
il segno di koplik in corso di morbillo consiste nella comparsa di: piccole macchie biancastre sulla mucosa delle guance
il serbatoio del virus della parotite è: l'uomo
il tempo di emivita del virus hiv in circolo è di: poche ore
il test tubercolinico positivo indica: infezione tubercolare
il trattamento delle forme di epatite cronica da hbv (hbv-dna pos; hbe-ag pos) prevede l'impiego di: interferone
il virus della immunodeficienza umana è compreso nella famiglia dei: lentivirus
il virus dell'epatite delta (hdv) si replica nell'epatocita in presenza di hbv
il virus epatitico c è un: flaviviridae
il virus hiv e' capace di infettare: tutte le precedenti
il virus influenzale si trasmette per: via aerogena
in caso di rosolia congenita, l'escrezione virale, nel tratto respiratorio e nelle urine, puo' durare fino a: un anno
in caso di sepsi la replicazione batterica avviene nel: focolaio sepsigeno
in corso di brucellosi quale complicanza è più frequente: orchite
in corso di infezione da hiv, l'infezione disseminata da micobatteri non tubercolari: si verifica solitamente per livelli di cd4<100
in corso di mononucleosi infettiva i linfociti che sono evidenziabili nella caratteristica formula sono cellule a fenotipo: cd8+
in corso di mononucleosi infettiva i rari casi letali sono dovuti a: rottura della milza
in presenza di febbre, tachicardia, ipotensione, tachipnea e leucopenia si potrebbe pensare a: sepsi da gram-negativi
in quale delle sottoelencate meningiti si ha una glicorrachia costantemente ridotta meningite da mycobacterium tuberculosis
in quale distretto dell'organismo alberga il meningococco nei portatori: naso-faringe
in quanto tempo una sepsi da gram negativi non trattata può evolvere gravemente sino al decesso poche ore
in un bambino un quadro clinico caratterizzato da febbre, dolori addominali, tenesmo e diarrea acquosa con emissione di feci ricche di muco pus e sangue è suggestivo di infezione da: shigella
in un paziente con infezione da hiv, causa meno verosimile di infiltrati diffusi polmonari è: mycobacterium kansasi
in un paziente febbrile da alcune settimane il riscontro di pancitopenia ed ipergammaglobulinemia è suggestivo di quale delle seguenti malattie infettive : leishmaniosi
in un soggetto che si è punto con un ago proveniente da un soggetto hcv-rna positivo: non esiste attualmente alcuna profilassi post-esposizione
in una mononucleosi da ebv si riscontra : presenza di anticorpi eterofili
indicare la più grave complicanza delle sepsi da bacilli gram-negativi: shock settico
indicare quale delle asserzioni relative all'epatite b non è corretta: il più importante serbatoio d'infezione è costituito dai soggetti con infezione acuta
indicare, tra i seguenti antibiotici, quello ad azione batteriostatica: tetraciclina
infezione toxoplasmica in gravidanza: quale periodo a maggior rischio di infezione fetale iii trimestre
l' agente eziologico di leishmaniosi cutanea in italia è: l. infantum
la "disinfezione" comporta: la distruzione degli agenti patogeni
la biodisponibilita' dell'amoxicillina e' rispetto a quella dell'ampicillina: maggiore
la bronchiolite del bambino è più frequentemente causata da: virus respiratorio sinciziale
la cisticercosi è una patologia causata da taenia solium
la copertura vaccinale contro l'influenza epidemica è particolarmente consigliata a popolazione di età superiore a 64 anni
la crepitazione gassosa è un segno riscontrato in quale delle seguenti infezioni:: gangrena gassosa
la criptococcosi è: una micosi
la diagnosi di aids in una persona con sieropositività per hiv si formula in presenza di patologie opportunistiche specificamente classificate
la diagnosi di certezza di un'enterite da salmonelle si basa su: coprocoltura
la diagnosi eziologica diretta di meningite virale può essere fatta mediante: ricerca del genoma virale nel liquor mediante pcr
la diagnosi rapida di varicella zoster viene eseguita su: scraping delle vescicole cutanee
la distinzione in endocarditi acute e subacute si basa su: tutte le precedenti
la febbre ondulante è caratteristica di: brucellosi
la fetopatia da cytomegalovirus è più grave: quanto più è precoce l'epoca di infezione primaria materna in gravidanza
la formula leucocitaria in corso di brucellosi evidenzia: neutropenia
la granulomatosi settica del neonato è conseguenza di infezione materno-fetale da: listeria monocytogenes
la hand, foot and mouth disease (malattia della mano, piede, bocca) è dovuta a: virus coxackie a
la leucocitosi neutrofila è frequente nelle infezioni da : stafilococco aureo
la malattia linfoproliferativa associata ai trapianti d'organo e' stata messa in relazione all'infezione da: ebv
la meningite più frequente nei soggetti aids è quella da: criptococco
la mialgia epidemica o malattia di bornholm è caratterizzata da: palpazione dei muscoli fortemente dolorosa
la parotite è dovuta a: paramixovirus
la patogenesi delle manifestazioni cutanee in corso di malattie infettive è legata a: tutte le precedenti in base al patogeno in causa
la patologia del colera si basa: sull'azione della tossina prodotta dai vibrioni a livello intestinale
la perforazione intestinale rientra tra le complicanze in corso di: febbre tifoide
la peritonite batterica spontanea, temibile complicanza dell'ascite, è più frequentemente causata da: batteri gram negativi aerobi
la più importante malattia causata da micoplasmi è: polmonite atipica primaria
la più importante malattia causata da spirochete del genere borrelia è febbre ricorrente
la polmonite da klebsiella pneumoniae è più frequente nei: soggetti defedati e/o neutropenici
la positività dei marcatori hbsab e hbcab con negatività di hbsag indica: pregressa infezione
la presenza di un esantema maculo-papuloso a progressione cranio-caudale preceduto da febbre, tosse e congiuntivite è suggestivo di: morbillo
la presenza di un esantema maculo-papuloso ad elementi non confluenti localizzato inizialmente al volto ed al collo preceduto dalla comparsa di linfoadenopatie retroauricolari e suboccipitali è suggestivo di: rosolia
la prevenzione della brucellosi si avvale principalmente di: profilassi veterinaria ed igiene alimentare
la prevenzione della trasmissione verticale di hbv avviene tramite: immunoprofilassi passiva e attiva in nati da madre hbsag positiva
la profilassi antibiotica corretta in chirurgia: deve essere solo peri-operatoria
la profilassi della polmonite da pneumocystis carinii nei soggetti con infezione da hiv si effettua con: cotrimossazolo
la raccolta dell'espettorato per esame colturale può essere fatto: in qualsiasi momento della giornata se il paziente ha tosse produttiva
la reazione avversa piu' frequente in corso di terapia con amoxicillina/acido clavulanico e': rash cutaneo
la reazione che conduce allo shock settico è scatenata da strutture presenti nei microorganismi gram-positivi e gram-negativi. queste includono tutte le seguenti tranne una: liposomi
la reazione di paul-bunnell-davidson è generalmente positiva in caso di: mononucleosi infettiva
la reazione di wright permette di fare diagnosi di: brucellosi
la resistenza ai farmaci antiretrovirali riduce l'efficacia della terapia
la resistenza ai farmaci antiretrovirali è favorita da tutte le precedenti
la resistenza ai farmaci antiretrovirali insorge quando: la terapia non è in grado di sopprimere completamente la replicazione virale
la salmonella typhi nel primo settenario di malattia può essere isolata da: sangue
la scarlattina è un'infezione caratterizzata da esantema maculo-papulare a piccoli elementi
la scrofola è determinata da: micobatteri
la sepsi è caratterizzata da : gittate batteriche nel torrente circolatorio da un focolaio infettivo localizzato
la sindrome di reye è in molti casi secondaria a infezione da: virus influenzale
la sinusite acuta e' complicanza frequente di: rinite
la somministrazione di fluorochinoloni e' controindicata nei pazienti: pediatrici
la terapia con clindamicina puo' provocare un tipico effetto tossico. quale? colite
la terapia della meningite meningococcica si fonda sull'impiego di: betalattamici
la terapia delle infezione da stafilococchi meticillino-resistenti prevede in genere: glicopeptidi
la tetrade sintomatologia della mononucleosi infettiva è costituita da: febbre angina splenomegalia polilinfoadenopatia
la tossicità dei farmaci antiretrovirali è spesso correlata ad elevati valori di cmax e/o auc
la toxoplasmosi: può decorrere in modo asintomatico nell'ospite immunocompetente
la trasmissione della brucellosi si realizza per ingestione di latte e suoi derivati di origine da animali infetti
la vaccinazione antitifica è obbligatoria per gli alimentaristi
l'agente causale della varicella è un: herpesvirus
l'agente eziologico della mononucleosi infettiva è: virus di epstein barr
l'agente eziologico della scarlattina è streptococco
l'agente eziologico dell'esantema critico o roseola infantum è un virus erpetico
l'angiomatosi bacillare è più frequente in: pazienti immunodepressi
l'attuale vaccino utilizzato per la prevenzione dell'epatite b è costituito da: hbsag ricombinante
le esotossine batteriche sono: proteine
le infezioni delle alte vie respiratorie, nella maggior parte dei casi, sono dovute a: virus
le infezioni nosocomiali nelle unità di terapia intensiva sono: il 20-30% dei ricoverati
le macchie di janeway sono tipiche di quale malattia infettiva: endocardite infettiva
le polmoniti " community-acquired" sono quelle: acquisite al di fuori dell'ospedale, nella vita di ogni giorno
le resistenze ai farmaci antiretrovirali sono pre-esistenti all'inizio del trattamento e selezionate dalla terapia
le rickettsiosi umane sono quasi sempre trasmesse attraverso artropodi vettori
le seguenti sono manifestazioni indice di aids tranne: candidosi orale
l'embriopatia rubeolica si compone della classica tetrade: lesioni oculari, malformazioni cardiache, sordità, ipoevolutismo
l'emocoltura consiste nella "coltura" del sangue per la ricerca di agenti patogeni causa di malattie disseminate (per esempio: sepsi, endocardite) sono indispensabili prelievi ripetuti nelle 24 ore, perché la presenza nel sangue dei batteri è intermittente
l'emocoltura è utile per la diagnosi di: brucellosi
l'encefalomieliti post-inefettive possono essere conseguenza di: tutte le precedenti
l'endocardite del tossicodipendente, più spesso localizzata a livello del cuore di destra, è più frequentemente provocata da: stafilococco
l'epatite c cronicizza: in oltre il 50% dei casi
l'epatite cronica b " atipica" è caratterizzata da: anti hbe e hbv-dna positività
l'epatite da hav viene contratta: per via entero-orale
l'epatite da virus b si trasmette: per via parenterale e parenterale inapparente
l'epatite virale b si manifesta dopo un periodo di incubazione pari a: 2-6 mesi
l'eresipela è un processo infettivo localizzato in quale dei seguenti apparati: cutaneo
l'eresipela e' un'infezione cutanea causata da: streptococco
l'esantema critico o vi malattia colpisce prevalentemente: i bambini di età compresa fra 6 mesi e 3 anni
l'esantema del morbillo è preceduto da: fenomeni mucositici
l'esantema morbilloso è prevalentemente dovuto a: danno endoteliale provocato dall'attiva replicazione virale
l'esantema morbilloso si diffonde: in direzione cranio-caudale
l'esantema varicellare è di tipo: polimorfo (macule/papule/vescicole/pustole)
l'esantema varicelloso è prevalentemente dovuto a: localizzazione diretta del virus a livello cutaneo
l'evoluzione della intossicazione alimentare da tossina stafilococcica è comunemente: favorevole in alcune ore
l'hcv è un virus responsabile di: tutte le precedenti
l'hhv8 è ritenuto l'agente etiologico di quale delle seguenti patologie: kaposi
l'impiego di quale dei seguenti antibiotici è controindicato in caso di insufficienza epatica severa: isoniazide
l'impiego di quale dei seguenti antibiotici necessita una riduzione della posologia giornaliera in caso di insufficienza renale. amikacina
l'infezione da parvovirus b19 contratta in gravidanza può provocare nel prodotto del concepimento: grave anemia
lingua a fragola o a lampone può essere tipicamente riscontrata in corso di: scarlattina
l'intossicazione alimentare è una malattia: provocata da tossine batteriche
l'intossicazione alimentare stafilococcica è causata da: enterotossina prodotta da s. aureus
l'orchite come complicanza della parotite non può osservarsi all'età di: 3-5 anni
meningite a liquor limpido può essere causata da: mycobacterium tuberculosis
mycoplasma pneumoniae causa più frequentemente infezione respiratoria
nei malati di aids la più frequente localizzazione d'organo dell'infezione da cmv è: corioretinica
nel nostro paese in quale decade della vita attualmente prevale l'infezione da hiv tra i 30/40 anni
nella brucellosi: a+b
nella leishmaniosi viscerale si riscontrano prevalentemente anemia, leucopenia, ipergammaglobulinemia
nella meningite tubercolare il liquor è: limpido
nella polmonite da mycoplasma pneumoniae il sintomo più frequente è: tosse
nell'ambito delle infezioni nosocomiali quali sono quelle più frequenti infezioni urinarie
nelle malattie esantematiche, quale delle seguenti affermazioni è falsa sono esclusivamente batteriche
nelle meningiti, la cefalea è segno di: ipertensione endocranica
paziente con febbre, eritema migrante, cefalea e dolori articolarti è affetto più probabilmente da malattia di lyme
per la terapia della gastroenterite è più raccomandabile: la correzione degli squilibri idro-elettrolitici
per l'infezione perinatale da varicella sono a rischio neonati da madre che abbia presentato l'esantema varicelloso: da 5 giorni prima a due giorni dopo il parto
per quale dei seguenti virus la grande variabilita' antigenica e' dovuta alla capacita' di errore nella trascrizione da parte della trascrittasi inversa hiv
per quale delle seguenti categorie è obbligatoria la vaccinazione antimeningococcica? reclute
per quale delle seguenti complicazioni la eradicazione dello streptococcus pyogenes e' perseguita come misura di profilassi primaria malattia reumatica
per scabbia norvegese si intende: una grave forma di scabbia che compare negli immunocompromessi
qual è il reperto anatomo-patologico patognomonico del morbillo: cellule di warthin-finkeldey
qual è la complicazione più frequente della varicella: polmonite varicellosa
qual è l'esame più sensibile e specifico per l'identificazione dell'agente eziologico della scarlattina: tampone faringeo
quale antigene del virus epatite b induce anticorpi protettivi ed e' usato come vaccino antigene di superficie (hbsag)
quale complicazione è frequente in corso di pertosse. polmonite
quale dei seguenti agenti non è responsabile di epatite virale? hpv
quale dei seguenti antibiotici è un aminoglicoside: amikacina
quale dei seguenti antibiotici non è un macrolide gentamicina
quale dei seguenti batteri è gram-negativo neisseria meningitidis
quale dei seguenti batteri è gram-positivo clostridium tetani
quale dei seguenti batteri è sporigeno clostridium
quale dei seguenti e' meno frequentemente responsabile di polmonite nosocomiale streptococcus pneumoniae
quale dei seguenti farmaci è un anti-elmintico: albendazolo
quale dei seguenti farmaci è un inibitore delle proteasi utilizzato nella terapia dell'infezione da hiv: ritonavir
quale dei seguenti germi patogeni non è comunemente sensibile alle cefalosporine di 3° generazione: listeria
quale dei seguenti microrganismi è anaerobio: bacterioides fragilis
quale dei seguenti microrganismi è l'agente etiologico più frequentemente riscontrato nelle esacerbazioni acute delle bpco haemophilus influenzae
quale dei seguenti microrganismi è l'agente etiologico più frequentemente riscontrato nelle polmoniti da aspirazione: anaerobi
quale dei seguenti microrganismi è trasmesso all'uomo da i pidocchi borrrelia recurrentis
quale dei seguenti microrganismi è trasmesso all'uomo dalle pulci rickettsia typhi
quale dei seguenti microrganismi non è causa di infezione opportunistica in pazienti con depressione dell'immunità cellulo-mediata neisseria gonorrhoeae
quale dei seguenti microrganismi può essere trasmesso all'uomo tramite un morso di cane: tutti i precedenti
quale dei seguenti organi è colpito meno frequentemente in corso di parotite: rene
quale dei seguenti patogeni non è sensibile al metronidazolo: mycobacterium tubercolosis
quale dei seguenti patogeni non viene trasmesso all' uomo tramite l'assunzione di latte crudo e derivati: pasturella dagmatis
quale dei seguenti patogeni può essere responsabile di epatite tutti i precedenti
quale dei seguenti schemi terapeutici è quello di prima scelta nel tetano generalizzato: antitossina umana i.m., toilette della ferita, sedativi e miorilassanti e.v., terapia di supporto, penicillina e.v.
quale dei seguenti vaccini ha un rischio potenziale per soggetti sensibili all'uovo a + b
quale dei seguenti virus è responsabile di una dermatite vescicolare a decorso acuto, spesso recidivante: hsv
quale dei seguenti virus provoca più spesso meningite: virus della parotite epidemica
quale delle seguenti affermazioni a proposito della legionellosi è falsa si trasmette per via oro-fecale
quale delle seguenti affermazioni e' falsa: il virus dell'epatite c è causa di ascessi epatici
quale delle seguenti affermazioni riguardanti il parvovirus b19 è falsa: e' l'agente etiologico della roseola infantum
quale delle seguenti affermazioni riguardanti la nisseria meningitidis è vera.: altamente sensibile ai fattori ambientali
quale delle seguenti affermazioni riguardanti la polmonite pneumococcica è falsa ha un periodo di incubazione di circa 15 giorni
quale delle seguenti affermazioni riguardanti la scabbia è falsa.: il parassita sopravvive solo poche ore nei lenzuoli e vestiti
quale delle seguenti affermazioni riguardanti una donna che ha contratto la toxoplasmosi durante il primo mese di gravidanza è vera: il rischio di infezione è praticamente nullo
quale delle seguenti affermazioni riguardo la osteomielite tubercolare è falsa: la localizzazione generalmente è multipla
quale delle seguenti classi di antibiotici é più frequentemente coinvolta nelle reazioni allergiche esantematiche da farmaci: beta-lattamine
quale delle seguenti condizioni morbose è malattia marker di aids polmonite da pneumocystis carinii
quale delle seguenti infezioni contratte in gravidanza può determinare danno fetale: rosolia
quale delle seguenti infezioni cronicizza? epatite d
quale delle seguenti infezioni ha come complicanza il carcinoma epatocellulare epatite b e c
quale delle seguenti malattie infettive è più frequente ed a decorso più grave nei pazienti splenectomizzati: infezione pneumococcica
quale delle seguenti patologie legate ad infezioni da toxoplasma gondii è a carico esclusivamente di pazienti immunodepressi: encefalite
quale di queste anomalie può essere presente nel neonato con toxoplasmosi congenita: idrocefalo
quale di queste complicanze si può osservare in corso di parotite epidemica? tutte le suddette
quale di queste malattie è stata associata all'infezione da virus di epstein-barr (ebv) tutte le suddette
quale di queste malattie può avere come complicanza la formazione di un asceso epatico amebiasi
quale di queste malattie può presentarsi con meningite e tumefazione delle ghiandole salivari sottomascellari e sottolinguali: parotite epidemica
quale di queste meningiti è a liquor torbido da haemophilus influenzae
quale di questi antibiotici appartiene alla famiglia degli aminoglicosidi gentamicina
quale di questi batteri è spesso causa di intossicazione alimentare? stafilococco
quale di questi organi è più facilmente sede di idatidosi? fegato
quale e' il farmaco antivirale piu' comunemente usato nei confronti del citomegalovirus umano: gancyclovir
quale è il meccanismo d'azione dei fluorochinoloni inibizione della dna-girasi
quale è il test più utile per valutare la risposta sostenuta alla terapia antivirale per l'epatite cronica da hcv viremia qualitativa
quale è il vettore della malattia di lyme zecche del genere ixodes
quale e' la manifestazione clinica piu' evidente che fa seguito ad una infezione primaria dal virus dell'herpes simplex tipo 1 nel bambino: gengivo-stomatite
quale e' la piu' comune complicanza del morbillo nella prima infanzia: laringite stenosante
quale è l'obiettivo che si persegue con la terapia hart bloccare la replicazione virale
quale fra le seguenti ipotetiche formule leucocitarie e' piu' vicina alla norma n 68%, l 25%, m 5%, e 2%, b 0%
quale fra questi esantemi infettivi e' di natura vescicolare: herpes zoster
qual'è il fattore di rischio prioritario per batteriemia / sepsi nosocomiale presenza di catetere venoso centrale
qual'è la localizzazione più frequente di candida spp. nel paziente hiv positivo? candidiasi oro-faringea
quale malattia infettiva è caratterizzata da una sindrome epato-renale: leptospirosi
quale manifestazione clinica è più frequente in corso di parotite: pancreatite
quale significato si può attribuire all'isolamento di proteus dalle feci reperto normale nel 11-75% dei casi
quale specie micotica è maggiormente incidente come patogeno nosocomiale? candida spp.
quale struttura anatomica è primitivamente interessata nel tracoma? congiuntiva
quale tipologia di pazienti presenta rischio maggiore di infezione da aspergillus spp.? pz trapiantato d'organo
quale tra i seguenti agenti eziologici è causa più frequentemente di miocardite acuta coxsackie virus b
quale tra i seguenti agenti patogeni è più frequentemente responsabile di polmoniti negli anziani streptococcus pneumoniae
quale tra i seguenti antibiotici è da considerare di prima scelta nell'infezione da salmonella typhi: cloramfenicolo
quale tra i seguenti dati consente di escludere una endocardite infettiva assenza di febbre con ecografia transtoracica negativa
quale tra le seguenti costituisce la principale infezione opportunistica in corso di aids: polmonite da p. carinii
quale tra le seguenti rappresenta la principale complicanza extra cardiaca in corso di endocardite infettiva: fenomeni embolici
quale tra questi agenti infettivi rappresenta più spesso l'agente eziologico delle encefaliti nell'adulto: herpesviridae
quale tra questi antibiotici presenta un meccanismo d'azione rivolto esclusivamente contro i microrganismi gram-negativi aztreonam
quale tra questi e' il farmaco che ha attivita' anti-hbv: lamivudina
quale tra questi è l'agente più frequentemente causa di epatite fulminante hbv
quale tra questi segni è costantemente presente in corso di meningite acuta: rigor nucalis
quale tra questi segni può rilevarsi in corso di endocardite infettiva: macchie di roth
quale virus è il più frequente agente causale della malattia mani-piedi-bocca ? coxsackievirus
quale volatile è responsabile della trasmissione all'uomo della maggior parte dei casi di ornitosi in italia piccione
quali agenti patogeni sono indicati dall'acronimo "torch"? t.gondii/other/rubeovirus/cmv/hsv
quali alimenti sono più facilmente responsabili della intossicazione da stafilococco aureo creme pasticciere
quali apparati possono essere interessati in corso di carbonchio: tutti i precedenti
quali dei seguenti germi è più frequentemente responsabile della fascicolite necrotizzante streptococcus pyogenes
quali delle seguenti affermazioni riguardanti al pertosse è falsa: l'agente etiologico è la bordetella pertussis, cocco gram positivo immobile
quali delle seguenti complicanze è più frequente nel morbillo broncopolmonite
quali delle seguenti sequele può essere determinata dall'infezione intestinale da yersinia enterocolitica: artrite, congiuntivite, uretrite
quali delle seguenti sostanze è attiva sul toxoplasma: cotrimossazolo
quali di queste infezioni è significativamente correlata alla comparsa di carcinoma epatocellulare: hcv
quali di queste manifestazioni cliniche della toxoplasmosi connatale sono comprese nella "tetrade di sabin": idrocefalo, calcificazioni endocraniche, convulsioni, corioretinite
quali di questi animali può emettere con le feci oocisti di toxoplasma gatto
quali di questi batteri produce endotossine che stimolano i macrofagi ad iper-produrre citochine che favoriscono la sintesi delle proteine della fase acuta nello shock settico tutti i batteri sopraindicati
quali sono i principali antigeni dei virus influenzali emoagglutinina e neuroaminidasi
quali sono le caratteristiche del liquor nelle meningiti purulente batteriche: tutte le precedenti
quali sono le possibili conseguenze della rosolia congenita: tutte le precedenti
quali tra i seguenti farmaci esercita una spiccata attività antifungina itraconazolo
quali tra le seguenti epatiti virali può dar luogo a forma fulminante: tutte le precedenti
quali tra le seguenti neoplasie opportuniste è marcatrice di aids nei pazienti hiv+: tutte le precedenti
quali tra queste vaccinazioni è obbligatoria in italia nessuna delle precedenti
quanti sono i genotipi ad oggi noti di hcv: 6
se un germe è resistente a tutte le penicilline, a quale altra classe di antibiotici sarà quasi sicuramente resistente cefalosporine
secondo la definizione dei cdc 1993 perché un soggetto rientri in fase aids il numero dei linfociti cd4+ deve essere: =/<200/mm3
sintomo o segno quasi costante in corso di rosolia è: artralgia
sono agenti etiologici di meningite a liquor torbido: sia a che b
sono reperti di laboratorio indicativi per la diagnosi di epatite acuta da virus epatitici incremento pari a dieci volte, o maggiore, del livello plasmatico delle transaminasi (aminotransferasi)
stato settico, accompagnato da dissenteria ed artrite è un quadro clinico in cui è frequentemente in causa: yersinia enterocolitica
streptococchi emolitici di tipo alfa (viridanti) sono normalmente presenti nel cavo orale di: tutti i soggetti
streptococcus pneumoniae è un batterio gram-positivo
toxoplasma gondii è un: protozoo
tra i micobatteri non tubercolari, quello di più frequente riscontro nei pazienti hiv sieropositivi è: m.intracellulare/ m.avium
tra le seguenti forme morbose, quale non è causata da chlamydiae morbillo
tra le seguenti specie di brucelle, quale è patogena per l'uomo tutte le suddette
un bambino di 3 mesi che dopo 3 giorni di febbre elevata presenta una brusca remissione della temperatura con comparsa di un esantema rosaceo esteso a tronco e collo è affetto da: esantema critico
un diciottenne presenta febbre (38°), mal di gola, un lieve esantema al volto, al tronco e agli arti, malessere generalizzato e linfoadenopatia latero-cervicale, tampone faringeo negativo, leucocitosi con linfocitosi assoluta e 10% di linfociti atipici, transaminasi lievemente elevate, hbsag negativo. i sintomi e i reperti sono compatibili con una diagnosi preliminare di: mononucleosi infettiva
un neonato che presenta la mucosa orale arrossata, con piccole chiazze biancastre e la lingua disepitelizzata può essere affetto da: candidosi
un paziente con epatite cronica da virus c nessuna delle precedenti è esatta
un paziente con una conta di globuli bianchi di 15.000/mmc, di cui il 90% costituito da granulociti neutrofili, da quale delle seguenti malattie può essere affetto leptospirosi
un paziente si ricovera per febbre di orgine sconosciuta. tra gli esami di laboratorio vengono evidenziati: sieroreazione di widal con anticorpi anti-flagellari (anti-h) a titolo 1:160; igm anti ebv. in base a tali dati il paziente è affetto da: mononucleosi infettiva
un paziente ti consulta per un esame sui marcatori di epatite da virus b cosi' refertato: hbsag positivo, anti hbsag negativo, anti hbcag igm presenti, anti hbcag igg presenti a basso titolo. gli spieghi che: ha una infezione acuta in atto
un picco di citolisi epatica in un paziente affetto da epatite cronica b con transaminasi precedentemente 2-3 volte i valori normali potrebbe essere dovuto a : tutte le precedenti
un quadro clinico caratterizzato da artrite delle grandi articolazioni e anomalie neurologiche (meningite asettica e radicoloneuriti) preceduti alcuni settimane prima dalla comparsa di un' eritema migrante (a occhio di bue) accompagnato da febbre, rigor nucalis, mialgie ed astenia è suggestivo di infezione da: borrelia burgdoferi
un quadro clinico caratterizzato da diarrea acquosa accompagnata da crampi addominali, febbre, nausea, grave disidratazione e leucocitosi insorti dopo trattamento antibiotico protratto è suggestivo di infezione da: clostridium difficile
un quadro clinico caratterizzato da ulcerazioni dei genitali a margini non induriti e notevolmente dolenti a cui si associano linfadenopatie con suppurazione dei linfonodi è suggestivo di infezione da: haemophilus ducrey
un quadro clinico caratterizzato da un ascesso cutaneo con coinvolgimento destruente dell'osso ed emissione all'esterno di materiale purulento contenente "granuli di zolfo" è suggestivo di infezione da: nocardia brasiliensis
un quadro radiografico di polmonite interstiziale si associa più frequentemente a polmonite da mycoplasma pneumoniae
una coltura positiva da tampone faringeo per streptococco viridans impone: nessuna delle precedenti
una donna gravida alla quarta settimana di gestazione esegue il test torch. e' priva di anticorpi verso il toxoplasma gondii. le consigli: massima igiene alimentare e controllo sierologico periodico
una profilassi farmacologica anti-meningitica con antibiotici è indicata per i contatti in caso di esposizione a meningite da neisseria meningitidis
uno dei seguenti virus è causa delle verruche cutanee: papova
vdrl positiva e tpha negativa possono essere riscontrati in caso di: tutte le precedenti

Fonte: mininterno.net

Malattie infettive

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Malattie infettive

Malattie infettive

Tabella delle malattie più frequenti dovute a microrganismi conosciuti

DELLE MALATTIE INFETTIVE

2. TECNICHE COLTURALI

3. TECNICHE DI IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI

- terreni sintetici o definiti -

- terreni complessi -

4. ISOLAMENTO DEI VIRUS

- Uova embrionate -

inoculazione sulla membrana corion-allantoidea si effettua su embrioni di 10-12 giorni di età.

5. DIAGNOSTICA SIEROLOGICA

6. REAZIONI SIEROLOGICHE

- Antibiogramma mediante diffusione in piastra su terreno agarizzato -

Sono tutti procedimenti che si basano sulla manipolazione del DNA.

- Denaturazione del DNA -

- Estrazione del DNA -

Questo metodo consente il rilascio di DNA allo stato puro grazie all’azione di sostanze lisanti, trattamenti termici e meccanici (forze centrifughe).

Questa tecnica consente di effettuare diagnosi di malattie infettive anche su materiale in putrefazione.

- elettroforesi del DNA -

I frammenti di DNA sono in grado di migrare se messi in campo elettrico: usando la tecnica dell’elettroforesi su gel, è possibile isolare i diversi frammenti di DNA presenti in una molecola.

- PCR -

Malattie infettive

Malattie infettive

Malattie infettive

Tabella delle malattie più frequenti
dovute a microrganismi conosciuti